骨髓增生異常綜合征患者血漿nm23-H1水平的變化及其臨床意義的研究.pdf

1、目的:
　　 通過檢測骨髓增生異常綜合征(MDS)患者血漿nm23-H1蛋白水平,探討其表達(dá)水平變化與MDS分型、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。MDS是一組獨(dú)立的具有異質(zhì)性的克隆性造血干細(xì)胞疾病,其主要特征為無效造血所致的難治性血細(xì)胞減少和極易發(fā)展成白血病。MDS由于臨床表現(xiàn)不典型,血液學(xué)改變復(fù)雜、缺乏特異性,其診斷和治療比白血病更為困難。2002年WHO制訂了MDS的新分型標(biāo)準(zhǔn),代替了一直沿用的FAB分型。nm23基因是近年來分離鑒定的一

2、種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,與人類多種腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。該基因家族由8個成員構(gòu)成,其中研究最多的是nm23-H1基因,它在體外具有抑制轉(zhuǎn)移潛能而不影響原發(fā)腫瘤大小的能力。nm23-H1是目前最主要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,在乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、肝癌和惡性黑色素瘤等患者癌組織中的表達(dá)水平與癌組織的轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān),對腫瘤轉(zhuǎn)移有抑制作用；但在多種惡性血液腫瘤中,如白血病、MDS、淋巴瘤,作為分化抑制因子的nm23-H1基因的過表達(dá)往往提示預(yù)后不良

3、。設(shè)計(jì)本課題主要目的是首先對MDS患者進(jìn)行WHO分型,通過流式細(xì)胞儀檢測MDS患者免疫表型,然后檢測MDS患者不同分型階段以及治療后不同緩解階段血漿nm23-H1蛋白含量,以探討血漿nm23-H1蛋白水平的變化與MDS分型、免疫表型、病情發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系及其臨床意義。
　　 方法：
　　 1.86例患者首先從臨床表現(xiàn)、外周血及骨髓涂片形態(tài)學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)檢測、免疫表型檢測,部分患者行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查確診為MDS,然后按

4、照WHO分型標(biāo)準(zhǔn)分組。
　　 2.免疫表型采用直接免疫熒光技術(shù),流式細(xì)胞儀為肋公司FACS Calibur,熒光劑為異硫氫酸熒光素(FITC),藻紅蛋白(PE)。單克隆抗體的選擇包括髓系相關(guān)的CD13,CD14,CD15,CD33；淋系相關(guān)的CD3,C04,CD8,CD19,CD20；造血干/祖細(xì)胞相關(guān)的CD34,HLA-DR。以CD45/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門,每測定管收集10000個細(xì)胞,測定結(jié)果以Cell Quest軟件進(jìn)

5、行分析。除MPO≥1096為陽性外,其他抗原陽性率≥20％為陽性。
　　 3.采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測86例不同分型MDS患者血漿中nm23-H1蛋白含量,同時以50例正常健康人作對照。取靜脈血5ml,肝素抗凝,離心提取血漿,-80℃保存。檢測時取待測血漿在37℃環(huán)境下溫育30min,首先取nm23-H1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1支,按照說明書,以稀釋液和樣品液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋,共稀釋A～H8-管,標(biāo)準(zhǔn)品的濃度從A管250ng/m

6、l到B管125ng/ml,C管62.5ng/ml,D管31.25ng/ml,E管15.6ng/ml,F管7.8ng/ml,G管3.9ng/ml,H管為零對照管。加樣、加標(biāo)準(zhǔn)品、溫育、洗板、顯色、加終止液均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,酶標(biāo)儀測定450nm的OD值,樣品孔OD值=各孔測定OD值-空白孔OD值,計(jì)算樣品濃度。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。采用成組比較t檢驗(yàn)和配對比較t檢驗(yàn),P<0.05為差異有顯著性。
　　

7、 結(jié)果：
　　 1.免疫表型測定結(jié)果((x)±s):86例MDS患者分為低危組(RA+RARS+5q-綜合征)37例,中危組(RCMD+RCMD-RS+MDS-U)25例,高危組(RAEB-Ⅰ+RAEB-Ⅱ)24例。三組造血干/祖細(xì)胞相關(guān)抗原CD34與HLA-DR的表達(dá)率均顯著高于正常對照組(P<0.05)；高危組顯著高于中危組,中危組顯著高于低危組(P<0.05)。MDS三組髓系早期抗原CD13、CD33的表達(dá)率顯著高于正常對

8、照組(P(0.05),中危組高于低危組,高危組高于中危組。MDS組的髓系成熟抗原CD15的表達(dá)率低于正常對照組(P<0.05),高危組低于中危組,中危組低于低危組和正常對照組(P<0.01)。單核細(xì)胞表面相關(guān)抗原CD14的表達(dá)率中危組、高危組高于正常對照組(P<0.05),低危組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MDS低危組患者T淋巴細(xì)胞抗原CD3、CD4、CD8表達(dá)率與對照組相比差異無顯著性(P>50.05),B淋巴細(xì)

9、胞抗原CD19、CD20在高危組表達(dá)明顯低于正常對照組(P(0.01),顯示隨著MDS病情惡化,各組表達(dá)率逐漸減低。
　　 2.86例患者血漿nm23-H1蛋白測定結(jié)果((x)±s):MDS患者RA組血漿中nm23-H1蛋白水平為6.42±1.04ng/ml,PARS組6.76±0.87ng/ml、5q-綜合征組6.73±0.82ng/ml,此三組患者血漿nm23-H1蛋白水平與健康對照組(6.16±O.41ng/ml)相比無顯

10、著性差異(P>0.05)；RCMD組20.68±1.95ng/ml、RCMD-RS組25.31±1.66ng/ml、RAEB-Ⅰ組41.50±3.87ng/ml、RAEB-Ⅱ組54.95±5.44ng/ml、MDS-U組19.43±3.51ng/ml,此五組患者血漿nm23-H1蛋白水平明顯高于健康對照組(6.16±0.41ng/ml)(P<0.01)。所有患者(除5例死亡病例)治療后一年內(nèi)再次測定血漿nm23-H1蛋白,多數(shù)組測定值比

11、治療前有所降低；RA組、RARS組、5q-綜合征組和MDS-U組治療后與治療前血漿nm23-H1蛋白水平無顯著性差異(P>0.05)；而RCMD組、RCMD-RS組、RAEB-Ⅰ組和RAEB-Ⅱ組與治療前相比有顯著性差異(P<0.01)。治療后患者按照WHO關(guān)于MDS緩解程度分組,完全緩解組血漿nm23-H1蛋白水平為6.68±1.21ng/ml,與健康對照組(6.16±0.41ng/ml)比較無顯著性差異(P>0.05)；未緩解組為4

12、3.56±7.74ng/ml、已發(fā)展為急性白血病組為56.84±10.28ng/ml,與對照組比較則差異性顯著(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.MDS各組造血干/祖細(xì)胞標(biāo)志CD34、HLA-DR以及髓系早期標(biāo)志CD13、CD33的表達(dá)率高于正常對照組,成熟髓系標(biāo)志CD15的表達(dá)率低于正常對照組；且隨低危組向高危組進(jìn)展,CD34、HLA-DR、CD13、CD33的表達(dá)率逐漸增高,成熟髓系標(biāo)志CD15的表達(dá)率逐漸降

13、低。說明MDS造血干/祖細(xì)胞和髓系早期抗原表達(dá)增多,成熟髓系抗原表達(dá)減少；提示MDS異?？寺“l(fā)生于造血干/祖細(xì)胞,且以髓系干細(xì)胞異常為主。隨疾病進(jìn)展,MDS的惡性克隆逐漸呈現(xiàn)優(yōu)勢性增長而對正常造血產(chǎn)生抑制,使骨髓中以異常的惡性克隆造血細(xì)胞為主。T淋巴系抗原CD3、CD4、CD8在MDS各組的表達(dá)率與正常對照組無顯著性差異,B淋巴系抗原CD19、CD20在MDS各組的表達(dá)率低于正常對照組,隨低危組進(jìn)展至高危組,表達(dá)率進(jìn)一步減低,說明MDS

14、患者B淋巴系早期抗原減少。免疫表型檢測結(jié)果不僅證實(shí)MDS是一組惡性克隆性造血干細(xì)胞疾病,而且有助于MDS正確診斷分型。
　　 2.nm23-H1蛋白在MDS各病期患者血漿中都有表達(dá),表達(dá)水平均高于健康對照組。而且其表達(dá)水平隨著病情進(jìn)展增高,低危組低表達(dá),與健康對照組無顯著性差異；中危組、高危組高表達(dá),與健康對照組差異性顯著。說明nm23-H1蛋白表達(dá)水平與MDS分型及病情進(jìn)展呈正相關(guān),進(jìn)一步說明nm23-H1是一種分化抑制因子,

15、在造血祖細(xì)胞中nm23-H1有高表達(dá),而在骨髓和淋巴分化期間其表達(dá)下調(diào),它的高表達(dá)可抑制人白血病細(xì)胞的分化。
　　 3.治療后再次檢測,血漿nm23-H1蛋白在MDS患者不同病期表達(dá)水平均有所下降,各型患者治療后與治療前分別比較nm23-H1蛋白水平,RCMD組、RCMD-RS組、RAEB-Ⅰ組和RAEB-Ⅱ組與治療前相比有顯著性差異；中危組、高危組仍然明顯高于健康對照組。說明nm23-H1水平與MDS患者治療的療效有關(guān),它的表

16、達(dá)與造血系腫瘤的惡性生長、分化阻斷、耐藥等有關(guān),提示MDS患者中nm23-H1陽性及高表達(dá)者化療敏感性較差,預(yù)后不良。
　　 4.治療后MDS未緩解組和轉(zhuǎn)白組nm23-H1蛋白含量均比健康對照組及緩解組明顯增高,而且急性白血病組增高最為明顯。在MDS的病程中,初次治療時nm23-H1的表達(dá)水平較高,完全緩解組其表達(dá)水平下降,未緩解組rim23-H1表達(dá)水平較高,而轉(zhuǎn)白組nm23-H1持續(xù)高表達(dá)。說明nm23-H1的表達(dá)與造血細(xì)胞