新型肝癌標志物Glypican-3 ELISA檢測方法的建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:制備抗GPC3單克隆抗體和多克隆抗體,并建立GPC3 ELISA檢測方法,探討其在原發(fā)性肝癌血清學診斷中的應(yīng)用價值。 方法:分別構(gòu)建Glypican-3基因1333-1548 bp片段及73-1074bp片段的原核表達質(zhì)粒pET22b-GPC3(1333-1548bp)和pProEX Hta-GPC3(73-1074bp)，異丙基硫代-β-d-半乳糖苷( IPTG) 誘導(dǎo)蛋白表達，并用Ni-NTA 樹脂親和層析柱純化蛋白

2、。利用純化的GPC3蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)過HAT、HT選擇培養(yǎng)及有限稀釋法進行克隆化，制備抗GPC3的單克隆抗體，用ELISA、Western blot進行特性鑒定?；瘜W合成多肽GPC3-Ag1（73－86aa）CCSRKMEEKYQLTh和多肽GPC3-Ag3（382－396aa）ETLSSRRRELIQKLK，并分別與KLH偶聯(lián)。利用偶聯(lián)好的多肽GPC3-Ag1、GPC3

3、-Ag3及純化的GPC3蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備抗GPC3的多克隆抗體。從上述多克隆抗體和單克隆抗體中通過不同的抗體組合檢測陽性血清和陰性血清篩選最佳配伍抗體；通過棋盤滴定法確定包被抗體的最佳包被濃度和檢測抗體的最佳稀釋度，根據(jù)上述實驗選擇最優(yōu)條件建立雙抗體夾心ELISA方法。利用上述建立的ELISA方法，檢測HCC、肝炎、肝硬化、其他惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移患者及正常人血清，通過ROC曲線選擇最佳診斷界值，探討血清GPC3在HCC診斷

4、中的應(yīng)用價值。最后我們檢測了151例HCC患者血清AFP和GPC3水平，探討聯(lián)合檢測GPC3+AFP在HCC診斷中的應(yīng)用價值。 結(jié)果:獲得11株抗GPC3（25－358aa）單克隆抗體，其中7株為IgG1亞型、4株為IgG2a亞型，輕鏈均為κ鏈。7株抗GPC3（444－516aa）單克隆抗體，均為IgG1亞型，輕鏈均為κ鏈。獲得抗GPC3-Ag1，GPC3-Ag3，GPC3（444aa-516aa）三種多克隆抗體。經(jīng)Weste

5、rn Blot證實獲得單克隆抗體和多克隆抗體均可以特異識別GPC3抗原。成功地建立了雙抗體夾心ELISA定量方法，最低檢測量為1.6ng/ml，并將其應(yīng)用于肝癌病人血清GPC3抗原的檢測。根據(jù)ROC曲線結(jié)果，以30ng/ml為診斷界值，364例HCC患者中143例血清GPC3陽性，陽性率為39％；96例肝炎/肝硬化患者中6例血清GPC3陽性，陽性率為6.3％；106例正常人中3例血清GPC3陽性，陽性率為2.8％, 統(tǒng)計學分析表明HCC

6、患者血清和后兩組血清GPC3含量有顯著差異（P＝0.000）。我們同時檢測了151例HCC血清的AFP和GPC3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨以AFP為診斷指標時，HCC檢出率為49％，單獨以GPC3為診斷指標時，HCC檢出率為40％，而AFP＋GPC3聯(lián)合診斷時，HCC的檢出率提高到72％。 結(jié)論:通過自行制備的抗GPC3單克隆抗體和多克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA方法，該方法可以應(yīng)用于肝癌病人血清GPC3抗原的檢測。GPC3作為一種新