急性肝損傷新型血清標(biāo)志物BHMT的ELISA檢測方法的建立及臨床初探.pdf

1、急性肝損傷是目前臨床上導(dǎo)致死亡的重要原因之一,也是藥物開發(fā)的主要障礙之一。檢測肝損傷的指標(biāo)雖然有很多報道,但臨床常用的還是傳統(tǒng)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT),谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),堿性磷酸酶(ALP),γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)及膽紅素(BIL)等。這些傳統(tǒng)指標(biāo)的敏感性及肝特異性差強(qiáng)人意,臨床至今仍對高度敏感、特異的診療新指標(biāo)有實(shí)際需求。因此,尋找更早期、更具肝特異性、更高靈敏性的急性肝損傷指標(biāo)是本課題的研究目標(biāo)。另外,近年來免疫學(xué)檢測越來越普

2、遍,而且向自動化、微型化、高通量的方向發(fā)展,已成為檢驗(yàn)科最常用的檢測方法。免疫學(xué)方法與生化酶學(xué)法相比,可以避免同工酶的干擾,特異性更好。但是傳統(tǒng)的肝功檢測幾乎全部是基于生化酶學(xué)法,因此,發(fā)展一種基于免疫學(xué)的肝功檢測方法也是本課題的研究重點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)手段和美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的大規(guī)模平行測序(MPSS)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/)對人體和

3、小鼠組織進(jìn)行大規(guī)模高通量基因分析,獲得這些組織的mRNA表達(dá)譜。根據(jù)其在肝臟和其他組織中轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)量挑出133種待選肝特異性表達(dá)基因,并根據(jù)NCBIESTexpressiondatabase,確定了其中107種更具肝特異性。后又依據(jù)其表達(dá)蛋白是否屬于相似的蛋白家族進(jìn)行排除,并利用過量撲熱息痛(APAP)造成的小鼠肝急性損傷模型,對小鼠血清進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析,如蛋白質(zhì)譜,蛋白芯片以及免疫印跡等進(jìn)行層層篩選,最終確定了其中的20種肝特異性基

4、因的蛋白產(chǎn)物可以作為小鼠肝損傷的血清標(biāo)志物。本研究在此基礎(chǔ)上選擇了上述蛋白之一的甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶—BHMT(betainehomocysteineS-methyltransferase)作為研究對象,發(fā)展了人血清BHMT的檢測方法,并開展了初步的臨床研究與探索。
　　BHMT是一種含Zn2+的甲基轉(zhuǎn)移酶,參與S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteineSAH)及高半胱氨酸(homocysteine)的

5、代謝調(diào)節(jié)。BHMT具有較高肝特異性,符合篩選肝特異性基因的標(biāo)準(zhǔn):1)目的基因在肝臟中的表達(dá)量應(yīng)是在其他非肝臟組織表達(dá)量的五倍以上,或是在其他非肝臟組織表達(dá)量總和的兩倍以上;2)目的基因在肝臟中的表達(dá)量應(yīng)大于10tpm(transcriptspermillion)。而傳統(tǒng)的肝功指標(biāo)中ALT,AST,ALP,GGT均未能達(dá)到這個水平。此外,BHMT在大多數(shù)種屬的肝臟中都有大量表達(dá),約占肝臟可溶性蛋白總量的0.6～1.6％。因此BHMT具備了

6、作為較好的急性肝損傷新型血清標(biāo)志的重要特性。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期已制備并純化了重組人BHMT在大腸桿菌BL21中表達(dá)的蛋白。并以此純化蛋白為免疫原,獲得了純化的小鼠抗重組人BHMT單克隆抗體4D1和兔抗重組人BHMT多克隆抗體2-4-2。
　　在這些工作的基礎(chǔ)上,本研究又進(jìn)行了更深入的探索,并已取得如下進(jìn)展:1.獲得了純度較高的重組人BHMT真核表達(dá)蛋白。利用本實(shí)驗(yàn)室保存的含人BHMT全長序列的pGEX-4T1-BHMT為模板

7、,擴(kuò)增BHMT編碼片段,將其插入實(shí)驗(yàn)室保存的真核表達(dá)載體pCMV-Flag,轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,實(shí)現(xiàn)了重組人BHMT的真核表達(dá)。采用瓊脂糖親和介質(zhì)(Ni)對該表達(dá)蛋白進(jìn)行純化,獲得了純度較高的重組人BHMT真核表達(dá)蛋白,可作為下步ELISA法定量檢測人血清中BHMT含量的標(biāo)準(zhǔn)品。2.建立了檢測人血清中BHMT的ELISA雙抗夾心法。利用實(shí)驗(yàn)室前期制備的小鼠抗重組人BHMT單克隆抗體4D1,兔抗重組人BHMT多克隆抗體2-4-2和純化重

8、組人BHMT真核表達(dá)蛋白建立了檢測人血清中BHMT的ELISA雙抗夾心法。首先通過正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)選出最佳實(shí)驗(yàn)體系,應(yīng)用該實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行ELISA檢測。該方法的檢測范圍為0.82ng/ml～106.6ng/ml,可達(dá)到2個數(shù)量級,檢測擬合曲線的線性相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.999,并具有較好的準(zhǔn)確性。3.BHMT的臨床研究。用建立的ELISA法,檢測臨床血清樣本中的BHMT含量,探索BHMT和急性肝損傷之間的關(guān)系。結(jié)果如下:(1)首先,建立了正常人血清

9、中BHMT的95%醫(yī)學(xué)參考值范圍。檢測了體檢正常人血清樣本200例,建立了人血清中BHMT的95%醫(yī)學(xué)參考值范圍為0～16.70ng/ml。(2)探討B(tài)HMT和傳統(tǒng)肝功指標(biāo)ALT的相關(guān)性。檢測了48例ALT>40U/L(目前ALT的醫(yī)學(xué)參考值范圍是0～40U/L)的可疑急性肝損傷住院病例血清中的BHMT含量。做統(tǒng)計學(xué)Spearman秩相關(guān)分析后,得出rs=0.74992,P<0.001,說明BHMT和ALT之間有較好的正相關(guān)關(guān)系。(3)

10、評價BHMT判別肝損傷的診斷方法。檢測126例臨床樣本,其中包括正常人和可疑急性肝損傷病例。以BHMT判別急性肝損傷的兩種診斷方法:一種是血清中BHMT>33.39ng/ml(醫(yī)學(xué)參考值上限的2倍)判別為急性肝損傷,另一種是血清中BHMT>50.1ng/ml(醫(yī)學(xué)參考值上限的3倍)判別為急性肝損傷。兩種診斷方法分別與目前臨床傳統(tǒng)的肝損傷診斷方法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)Kappa一致性檢驗(yàn),使用單側(cè)檢驗(yàn),得出以BHMT>33.39ng/ml判別急性肝損

11、傷時,Kappa=0.7287,Z=8.29,P<0.001;以BHMT>50.10ng/ml判別急性肝損傷時,Kappa=0.8320,Z=9.38,P<0.001。由此可提示,兩種BHMT判別急性肝損傷的診斷方法與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)均有較高的一致性,其中以BHMT>50.10ng/ml判別急性肝損傷的診斷方法與傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)的一致性更高。(4)確定BHMT診斷急性肝損傷的Cut-off值。以上述ELISA法檢測的126份臨床血清樣本中的BHMT

12、含量,和按目前臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)判別肝損傷是否為陽性,繪制ROC曲線,得出BHMT判別急性肝損傷的Cut-off值為65.92ng/ml,其靈敏度為0.94,特異度為0.94,準(zhǔn)確度為0.94,約登指數(shù)為0.89。由此提示BHMT在診斷急性肝損傷中具有較高的診斷價值。(5)探討B(tài)HMT在反映肝損傷方面的特異性。因BHMT也分布于腎臟,故采用ELISA法檢測了20例腎損傷病例和20例正常人血清中的BHMT含量。將兩組數(shù)據(jù)做統(tǒng)計學(xué)成組設(shè)計定量資料

13、的Wilcoxon秩和檢驗(yàn),Z=-1.6167,P=0.1060>0.05,說明腎損傷病例和正常人血清中BHMT含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示BHMT含量的變化可能與腎損傷無關(guān),其反映肝損傷的特異性可能較好。(6)探討B(tài)HMT在反映肝損傷方面的靈敏性。ELISA法檢測5例急性肝損傷病例病程中血清BHMT含量的變化情況,繪制變化趨勢圖。5幅變化趨勢圖均可提示:在急性肝損傷的過程中,BHMT較ALT可能更靈敏些,BHMT達(dá)到高值的時間點(diǎn)更早,