靶向肝臟基因組位點特異性整合治療血友病B的初步研究.pdf

1、研究背景和目的:血友病B是一種由于凝血因子以缺乏導致的嚴重出血性疾病，為X染色體連鎖隱性遺傳。主要臨床表現(xiàn)是不可預測的、反復自發(fā)性軟組織及大關節(jié)出血.臨床上乙型血友病的嚴重程度與循環(huán)中FIX(coagulation factorIX)的水平相關。目前的替代療法己經(jīng)在很大程度上降低了出血發(fā)生的頻率以及繼發(fā)的關節(jié)疾病，并大大的提高了血友病病人的生存期。但是血漿濃縮FIX可能引起傳染性疾病，而純化FIX所需費用巨大。血友病B是很好的基因治療研

2、究模型。一般來說，杯IX(human FIX)基因可以通過病毒或非病毒載體進行輸送.近年來，非病毒載體的研究越來越受到重視。噬菌體整合酶phiC31可以在哺乳動物細胞內(nèi)發(fā)揮作用，被應用與基因工程包括基因治療的研究.在哺乳動物細胞，這種酶介導帶有attB位點的質(zhì)粒整合入宿主基因組中的假attP位點。Aneja及其同事發(fā)現(xiàn)外來質(zhì)粒與整合酶編碼質(zhì)粒共注射才能實現(xiàn)外源基因在肺臟持續(xù)表達，而單獨注射外來質(zhì)粒則不能。本研究的主要目的是通過高壓尾靜脈

3、注射把攜帶attB和hFIX的質(zhì)粒與表達phiC31的質(zhì)粒共同導入肝臟細胞，檢測目的質(zhì)粒能否整合入小鼠基因組并持續(xù)表達。方法:首先構建表達hFIX并攜帶attB核心序列的真核表達載體attB-hFIX-pIRES2-EGFP并在體外驗證該載體能否表達目的基因.然后用高壓尾靜脈注射的方法將該載體與表達戶iC31的質(zhì)粒CMV-int共注射血友病B小鼠，attB-hFIX-pIRES2-EGFP單獨注射為對照。用ELISA的方法檢測hFIX在

4、其體內(nèi)的表達;用出血時間評價血友病小鼠出血癥狀是否改善;用巢式PCR檢測attB-hFIX-pIRES2-EGFP是否整合到基因組的整合熱點mpsLl(mouse pseudo-sitefrom liver1準點.結果:經(jīng)鑒定，atkB-hFIX-pIRES2-EGFP載體構建成功，并在體外表達hF1Aa高壓尾靜脈注射血友病B小鼠后24小時，hFIX血清水平達到最高值，為正常水平的30％，此時小鼠的出血癥狀明顯改善。但是不論是否與CMU

5、 int共注射，此后hFIX水平迅速下降，在注射后10天內(nèi)降到本底水平。巢式PCR的結果證實，attB-hFIX-pIRES2-EGFP整合到了小鼠肝臟基因組的mpaLl位點。結論:phiC31可以將34bp的attB最短序列整合到小鼠基因組的整合熱點mpsLl;由CMV啟動hFIX的能夠瞬間高表達并有效改善血友病小鼠的出血癥狀;但是外來DNA進入細胞后，無論是否整合到基因組均被迅速沉默，說明肺臟和肝臟對整合入基因組的C州rV啟動子表達

6、調(diào)控的機制不盡相同，因此對用于基因治療的裸DNA進行改進使其適合在靶器官表達是十分必要的。
　　 背景和目的:目前用于血友病基因治療的載體主要分為兩大類:病毒載體和非病毒載體。這兩類載體各有優(yōu)缺點。病毒載體基因傳遞的效率高，但容易產(chǎn)生免疫反應和插入突變;非病毒載體制備簡單，安全性好，但是基因轉導的效率低。因此我們試圖構建一種即可高效感染靶細胞又能實現(xiàn)安全定點整合入宿主基因組的腺病毒嵌合載體。方法:通過一系列DNA操作構建腺病毒·

7、整合酶嵌合系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含兩個腺病毒載體:一個攜帶轉基因表達框，表達框內(nèi)有hFIX，紅色熒光蛋白編碼序列以及attB(phiC31識別位點)，表達框兩側各有一個loxp( Cre識別位點).另一個腺病毒載體攜帶Cre和phiC31基因。同時構建只表達Cre和只表達phiC31的載體作為對照載體。在體外分別用脂質(zhì)體轉染293A細胞，用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達，用RT PCR鑒定各個基因的表達。結果:經(jīng)PCR,酶切及測序方法鑒定，該腺病