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文檔簡介
1、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文Aβ寡聚體特異性scFv的篩選、鑒定和親和力成熟的初步研究姓名:包福祥申請學(xué)位級別:博士專業(yè):基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師:曹貴方何金生20090401Selection,IdentificationandpreliminarystudyofAffinityMaturationofscFvSpecificAgainstA1342OligomersAbstractAIzheimer’Sdisease(AD)iSthemos
2、tprevalentneurodegeneratiVediseaseIntheelderThediseaseischaracterizedbymemoryimpairmentandcognitiveobstacleThecurrenttreatmentsofADprovideonlysymptomaticreliefandarepracticall)inefficientNowantiA13antibodieshavebeensugge
3、stedasapotentialtherapeuticstrategyforthetreatmentofADGeneticengineeringmadeitpossibletOgenerateantibodywithoutconstantregionwhichistermedscFv(singlechainfragmentvariable)orFab(Antigenbindingfragment)ScFvisasmallerfuncti
4、onalunitremainingantigenicspecificityandaffinityComparedwithotherantibodies,scFvhaSmanyadvantages,smallersize,reducedimmunogenicity,sgongerpenetratingpower,rapidlocalizationandbeingeaSilyclearedupfromthenormaltissueMeanw
5、hile,scFvCanbeproducedinlargescaleinbacteriaoryeastandmanipulatedb’geneticengineeringThereforedevelopingscFvisofgreatsignificanceintheareasofADdiagnosisandtherapyToconstructthehumansinglechainFv(scFv)antibodylibrarybypha
6、gedisplaytechnologyandobtainthespecificscFvs(single—chainfragmentvariable)againstsolubleAp142(Amyloidbeta)oligomersbyscreeningthehumanscFvlibrary,peripheralbloodlymphocytes(PBL)wereseparatedfromtenhealthydonors,andthetot
7、alRNAWaSextractedfromthePBLThevariableheavy(VH)andvariablelight(VL)geneswereamplifiedbyRTPCRandthenthescFvwasobtainedthroughSOEPCRThescFvfragmentswereclonedintothevectorpCANTAB5EandelectroporatedintocompetentEcoliTGlcell
8、sandthenascFvphagedisplaylibrarycontaining25x10’clonesWaSgainedTherecombinantphagemidswererescuedbyreinfectionofhelperphageMI3K07RecombinantphagesspecificforApI42oligomerswereenrichedafterfourroundsofbiopanningandtheanti
9、gen—positivecloneswereselectedfromtheenrichedclonesbyphageELISAPositivecloneB19WaSusedtoinfectEcoliHB2151toexpresssolublescFvThesolublescFvantibodieswereexpressedsuccessfully,anddisplayedspecificbindingtOAp142trimerandpr
10、otofiberbySDSPAGEandWesternblotanalysisThebindingaffinityofsolublescFvantibodiestoA136420ligomersWaS910。6mol/LForthepurposeofaffinitymaturation,theVHandVLgenefiagmentswereclonedintothepComb3C/cFabvector,andtransformedtOc
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