5-羥基多甲氧基黃酮抗結(jié)腸癌活性及其分子機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是致死率最高的癌癥之一。隨著西方的飲食習(xí)慣和生活方式越來越趨于國際化,結(jié)腸癌的發(fā)生率也在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。我們致力于尋找新穎的膳食功能因子來預(yù)防和抑制結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。多甲氧基黃酮是一類結(jié)構(gòu)獨特的黃酮類化合物,主要存在于橘屬類果實的皮中(陳皮)。目前我們在陳皮中分離得到了一類新穎的多甲氧基黃酮類化合物,也就是5-羥基多甲氧基黃酮。其新穎的結(jié)構(gòu)特點賦予其更加強(qiáng)大的抗腫瘤活性。越來越多的研究表明,特定的具有預(yù)防或抑制腫瘤生長的藥

2、物之間在低劑量下聯(lián)合使用可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),這不僅能增強(qiáng)抑制腫瘤的活性而且能降低由于高劑量而引發(fā)的毒副作用。阿托伐他汀是是目前臨床最常用的降膽固醇的藥物,它通過抑制肝臟內(nèi)HMG-CoA還原酶的活性來降低血漿中膽固醇和脂蛋白水平。最新的報道顯示阿托伐他汀對多種癌細(xì)胞具有潛在的抑制活性,尤其是結(jié)腸癌細(xì)胞。利用先進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型,本課題對三種最主要的5-羥基多甲氧基黃酮抗結(jié)腸癌活性及其分子機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)而深入的研究,并在此基礎(chǔ)上開創(chuàng)性地研究

3、了一個全新的抗癌策略:利用5-羥基多甲氧基黃酮與阿托伐他汀聯(lián)合使用而對結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的協(xié)同抑制效應(yīng)。具體實驗結(jié)果如下:
　　 1.5-羥基多甲氧基黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞的顯著抑制作用在此研究中,我們檢測了三個主要的5-羥基多甲氧基黃酮,5-羥基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黃酮(5HPMF),5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮(5HHMF),和5-羥基-6,7,8,4'-四甲氧基黃酮(5HTMF)抑制兩種人類結(jié)

4、腸癌細(xì)胞(HCT116和HT29細(xì)胞)增殖的效應(yīng),同時,我們也系統(tǒng)的比了三個主要5-羥基多甲氧基黃酮與其母體多甲氧基黃酮(分別是:川陳皮素(PMF)、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮(HMF)及橘紅素(TMF))抗結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用。結(jié)果顯示,與母體全甲氧基化的多甲氧基黃酮相比,5-羥基多甲氧基黃酮具有更強(qiáng)的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用,這表明5-位的羥基基團(tuán)在增強(qiáng)5-羥基多甲氧基黃酮抗腫瘤活性方面起到了重要作用。流式細(xì)胞儀的

5、分析結(jié)果顯示,三個5-羥基多甲氧基黃酮能分別對腫瘤細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡產(chǎn)生不同的效應(yīng),這表明三個5-羥基多甲氧基黃酮分別通過不同的作用機(jī)制來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長。例如,5HPMF可引起HT29細(xì)胞G2/M細(xì)胞周期滯留,而5HHMF誘導(dǎo)顯著的G0/G1細(xì)胞周期滯留:相反,5HTMF可增加sub-G0/G1期細(xì)胞數(shù)目。為了進(jìn)一步確認(rèn)三個5-羥基多甲氧基黃酮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用機(jī)制,我們對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析,結(jié)果表明5-羥基多甲

6、氧基黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用主要基于它們強(qiáng)效調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡相關(guān)重要蛋白的能力(例如,p21Cip1/Waf1,CDK-2,CDK-4,phosphor-Rb,Mcl-1,caspases3&8,和PARP等蛋白)
　　 2.5-羥基多甲氧基黃酮以p53,Bax和p21依賴方式抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長利用人類結(jié)腸癌HVT116細(xì)胞的多種等基因變種細(xì)胞(例如:p53+/+,p53-/-,Bax+/-,Bax-/-,p21-/-細(xì)

7、胞),我們進(jìn)一步研究了重要腫瘤調(diào)控蛋白p53,Bax和p21在三個主要5-羥基多甲氧基黃酮誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞周期滯留和細(xì)胞凋亡中的作用與影響。Annexin V/PI雙染實驗結(jié)果表明,5HHMF和5HTMF能顯著地誘導(dǎo)HCT116(p53+/+)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡,而相同濃度的5HHMF和5HTMF處理相同的時間對HCT116(p53-/-)細(xì)胞卻無影響。另一方面,5HHMF和5HTMF能顯著地誘導(dǎo)HCT116(Bax+/-)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡,

8、而對HCT116.(Bax-/-)細(xì)胞卻作用甚微。三個5-羥基多甲氧基黃酮都能增加HCT116(p53+/+)細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)目,而對HCT116(p53-/-)和HCT116(p21-/-)細(xì)胞卻毫無作用。免疫印跡分析結(jié)果表明,5HHMF和5HTMF能顯著地增加HCT116(p53+/+)和HCT116(Bax+/-)中活化的caspase-3和活化的PARP的含量,而在HCT116(p53-/-)和HCT116(Bax-/-)

9、細(xì)胞中,5HHMF和5HTMF卻只能微弱的增加這兩種活化的蛋白的含量。綜上所述,我們的結(jié)果表明,5-羥基多甲氧基黃酮,特別是5HHMF和5HTMF以p53、Bax和p21依賴性方式來誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期滯留。
　　 3.5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮(5HHMF)對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用
　　 5HHMF具有顯著的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用,它能誘導(dǎo)細(xì)胞周期滯留和細(xì)胞凋亡,并能廣泛地調(diào)節(jié)重要的信號

10、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。我們在上述研究的基礎(chǔ)進(jìn)一步深入地剖析了5HHMF抑制人類結(jié)腸癌細(xì)胞生長的分子作用機(jī)制。結(jié)果表明,5HHMF能以劑量依賴方式抑制HT29、HCT16及SW620等多種人類結(jié)腸癌細(xì)胞的集落形成能力,而且,與以往已報道的結(jié)果不同的是5HHMF抑制細(xì)胞生長的作用不是通過產(chǎn)生活性氧化物質(zhì)(ROS)實現(xiàn)的。5HHMF能選擇性地改變與細(xì)胞膜相關(guān)的重要蛋白,例如K-Ras,EGFR及它們的下游效應(yīng)物Akt和NFkB的活性。5HHMF也能有效的

11、地抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路:它能以劑量依賴方式降低細(xì)胞核內(nèi)β-Catenin的含量,增加細(xì)胞漿內(nèi)E-cadherin的含量。血管生成對腫瘤的發(fā)展有著重要的意義,5HHMF還能以劑量依賴方式有效地抑制血管生成。以上結(jié)果表明,5HHMF能從細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核及血管生成方面來全方位地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長。
　　 4.5-羥基川陳皮素(5HPMF)和5-羥基橘紅素(5HTMF)體內(nèi)抗結(jié)腸癌活性及其藥代動力學(xué)研究
　　 上述研究

12、表明5HPMF和5HTMF具有很強(qiáng)的抑制人類結(jié)腸癌細(xì)胞生長及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。我們利用氧化偶氮甲烷(AOM)-誘導(dǎo)的結(jié)腸癌大鼠模型進(jìn)一步研究了5HPMF和5HTMF的體內(nèi)抗結(jié)腸癌活性。用AOM(15 mg/kg)注射F344大鼠兩次,每周一次,然后喂食脂肪含量為20％并混有5HPMF和5HTMF(0.05％和0.1％)的高脂食物8周后處死病取大腸。ACF(結(jié)腸癌早期指標(biāo))的形成作為實驗的結(jié)束點。結(jié)腸的ACF用亞甲基藍(lán)染色后在顯微鏡

13、下進(jìn)行分析。結(jié)果表明5HPMF能以劑量依賴方式降低每只大鼠總的ACF的數(shù)目及Ac的數(shù)目。而且5HPMF的作用明顯強(qiáng)于5HTMF的作用,例如,5HPMF在降低總的ACF和high-grade dysplasia的作用都顯著強(qiáng)于5HTMF。但是這些體內(nèi)抗腫瘤結(jié)果與體外抗腫瘤研究的結(jié)果正好相反:體外研究表明5HTMF在三個5-羥基多甲氧基黃酮中具有最強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長及殺死細(xì)胞的作用。為了進(jìn)一步探索體內(nèi)外實驗結(jié)果差異的原因,我們對5HPMF

14、和5HTMF進(jìn)行了入血成分、排泄及臟器分布研究。結(jié)果表明,5HPMF和5HTMF的濃度都在60min左右時在血清內(nèi)達(dá)到峰值,并且5HPMF在血清中的濃度是5HTMF的10倍左右;5HPMF在尿液中總的排泄量和排泄率都高于5HTMF。結(jié)合我們的以前研究我們推測5HTMF具有很弱的水溶性,其脂溶性也比5HPMF低,這使其不易透過生物膜被吸收進(jìn)入血液,因而其在血液中的濃度相對很低,不能起到抑制ACF形成的作用。
　　 5.5HPMF和

15、阿托伐他汀聯(lián)合使用對結(jié)腸癌細(xì)胞的協(xié)同性抑制效應(yīng)
　　 5HPMF在橘皮中具有較高的含量并且它還具有較強(qiáng)的抑制人類結(jié)腸癌細(xì)胞生長的活性,阿托伐他汀是HMG-CoA還原酶抑制劑,它也是一種潛在的抗癌藥物。在此項研究中我們開創(chuàng)性地研究了一個全新的抗癌策略:低劑量阿托伐他汀和5HPMF聯(lián)合用藥。阿托伐他汀或5HPMF單獨使用時可產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的效應(yīng),但是兩者聯(lián)用后可產(chǎn)生更加強(qiáng)大的抑制效應(yīng)。根據(jù)等效線圖解法分析得知,低劑量阿

16、托伐他汀和5HPMF聯(lián)合用藥產(chǎn)生的對結(jié)腸癌細(xì)胞的強(qiáng)大抑制來源于兩者的顯著協(xié)同效應(yīng)。流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果表明,阿托伐他汀和5HPMF聯(lián)合用藥24h后,能協(xié)同性地使大量的細(xì)胞滯留在G0/G1期;而聯(lián)合用藥48h或更長時間后,可協(xié)同性地誘導(dǎo)顯著而廣泛的細(xì)胞凋亡效應(yīng)。阿托伐他汀和5HPMF聯(lián)合用藥對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抑制效應(yīng)要比單獨使用阿托伐他汀或5HPMF產(chǎn)生的效應(yīng)顯著很多。我們進(jìn)一步的研究表明,阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥所產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)與增

17、加p21Cip1/Waf1和p27Kip1蛋白的含量;降低CDK-2、CDK-4、CDK-6、Cyclin D1、Mcl-1及p-Rb(Ser780)蛋白的含量;及激活caspase級聯(lián)反應(yīng)緊密相關(guān)。阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥也能選擇性地抑制與細(xì)胞膜相關(guān)的重要蛋白,例如K-Ras,EGFR及它們的下游效應(yīng)物Akt的活性。阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥可協(xié)同性地降解細(xì)胞膜上EGFR,同時它還能誘導(dǎo)腫瘤抑制蛋白p38 MAPK的磷酸化(

18、活化)。當(dāng)我們利用p38 MAPK siRNA減低p38基因表達(dá)后,阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥誘導(dǎo)的EGFR降解得以抑制。這表明阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥可經(jīng)p38 MAPK的活化而造成細(xì)胞膜EGFR的表達(dá)量降低。綜上所述,我們的實驗結(jié)果顯示阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥可在抑制人類結(jié)腸癌細(xì)胞生長和殺死腫瘤細(xì)胞方面產(chǎn)生很強(qiáng)的協(xié)同效用,這種協(xié)同效應(yīng)是通過廣泛地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,造成細(xì)胞周期滯留,和調(diào)控重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實現(xiàn)的。我們的研

19、究有力的證明了阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥的光明前景,為下一步的臨床實驗提供了強(qiáng)有力的證據(jù)和生物指標(biāo)。
　　 綜上所述,5-羥基多甲氧黃酮相比于其母體全甲氧基化的多甲氧基黃酮具有更強(qiáng)的抑制人類結(jié)腸癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。5-羥基川陳皮素與阿托伐他汀聯(lián)合使用可協(xié)同性地抑制人類結(jié)腸癌細(xì)胞的生長,增加細(xì)胞凋亡。還可以通過抑制表皮生長因子受體(EGFR)激活,降低膜蛋白K-RAS的表達(dá)進(jìn)而抑制其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)其抗癌活性。