金雀異黃素抗結(jié)腸癌作用及其機(jī)制的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究金雀異黃素(Genistein.Gen)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討Gen抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制，為尋求結(jié)腸癌治療新的藥物提供理論依據(jù)。 方法： 1、體外實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)比色法測(cè)定Gen對(duì)該細(xì)胞的增殖抑制作用，選擇合適的實(shí)驗(yàn)劑量；采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期和凋亡

2、率；普通光學(xué)顯微鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；采用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)半定量檢測(cè)Gen誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡過程中相關(guān)蛋白PCNA、P21、VEGF的表達(dá)情況。 2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：取健康雄性BALB/c小鼠(60只)稱重，采用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠隨機(jī)分為5組(每組12只)：對(duì)照組(生理鹽水)：Gen低劑量組(1mg/kg)；Gen.中劑量組(10mg/kg)；Gen高劑量組(20mg/kg)；5-氟尿嘧啶組

3、(5-Fu)。將colon26細(xì)胞皮下接種于各組小鼠，建立荷瘤小鼠模型。當(dāng)各組小鼠可觸及到瘤體時(shí)開始給藥，采用腹腔注射給藥方式：對(duì)照組給予含二甲基亞砜(DMSO)的生理鹽水0.2ml(DMSO<1％)；治療組給予不同劑量的Gen，每日給藥一次，連續(xù)給藥14天；5-Fu組給予5-Fu 0.2ml(16.5 mg/ml)，每周腹腔注射一次，共兩次。在此期間觀察小鼠一般情況并記錄體重和腫瘤大小。給藥后第十五天將所有小鼠稱重后處死，立即剝瘤、稱

4、重。計(jì)算腫瘤體積和抑瘤率。應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期及凋亡率。應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)移植瘤組織PCNA、P21、VEGF蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.1 Gen對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響：MTT檢測(cè)結(jié)果顯示10、20、40、80μg/ml Gen對(duì)SW480細(xì)胞增殖具有抑制作用。不同濃度Gen處理細(xì)胞24～72h后，各實(shí)驗(yàn)組OD值均有不同程度下降，與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P<0.01)。隨著G

5、en濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值逐漸下降。Gen對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。抑制率以80μg/ml Gen作用72h為最高，可達(dá)60.2％。 1.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：0、20、40、80μg/ml Gen作用SW480細(xì)胞48h后，隨藥物濃度增加，G2/M期細(xì)胞逐漸增多，G0/G1期細(xì)胞逐漸減少。提示Gen可阻滯SW480細(xì)胞周期于G2/M期，該作用有劑量依賴性。0、20、

6、40、80μg/mlGen作用細(xì)胞48h后，凋亡百分率分別為：1.40％、8.01％、24.22％、47.01％。流式細(xì)胞儀可測(cè)得典型的亞二倍體凋亡峰，凋亡率隨Gen濃度增加而逐漸升高。各處理組的凋亡率與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P<0.01)。 1.3 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化結(jié)果顯示：未經(jīng)藥物作用的細(xì)胞形態(tài)多樣，有圓形、梭形及多邊形，形態(tài)飽滿，藥物作用后細(xì)胞皺縮，破裂，有的細(xì)胞兩端出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的偽足，細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)空泡，脫落細(xì)胞增

7、多。 1.4 透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變：細(xì)胞體積縮小，微絨毛數(shù)量減少，核膜皺縮，核染色質(zhì)高度濃縮，電子密度增高，邊集于核膜下，形成沿核膜收縮的新月狀小體。 1.5 流式細(xì)胞儀半定量檢測(cè)SW480細(xì)胞中PCNA、P21、VEGlF蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：0、20、40、80μg/ml Gen作用SW480細(xì)胞48h后，PCNA、VEGF蛋白的熒光指數(shù)FI值均隨處理濃度增大而逐漸降低。P21蛋白的熒光指數(shù)FI值隨處理濃度

8、增大而逐漸增大。對(duì)于每一種蛋白，比較其處理組和空白對(duì)照組的FI值，均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。 2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 2.1 Gen明顯抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，各組小鼠處死后腫瘤體積的比較，Gen低、中、高劑量組和5-Fu組腫瘤體積明顯低于對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.01)，且實(shí)驗(yàn)組的腫瘤體積隨Gen劑量的增大而減小。Gen低、中、高劑量組和5-Fu組的抑瘤率分別為：11.7％、28.8％、40.8％、62

9、.0％，三個(gè)用藥組的抑瘤率隨Gen劑量的增大而增加。 2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：Gen低、中、高劑量組與對(duì)照組相比，G2/M期細(xì)胞逐漸增多，G0/G1期細(xì)胞逐漸減少。提示Gen可阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，該作用有劑量依賴性。對(duì)照組、Gen低、中、高劑量組和5-Fu組的凋亡百分率分別為：3.16％、10.26％、19.35％、27.27％，49.64％。不同劑量Gen組和5-Fu組均測(cè)得典型的亞二倍體凋亡峰，凋亡率隨Gen劑

10、量的增加而逐漸升高。Gen各劑量組、5-Fu組的凋亡率與對(duì)照組相比，均有顯著性差異(P<0.01)。 2.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：PCNA、P21蛋白表達(dá)于細(xì)胞核，VEGF蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞，可見棕黃色著色。 按照IHS值法進(jìn)行免疫組化評(píng)分。PCNA、VEGF蛋白表達(dá)值(IHS值)隨Gen劑量的增大而逐漸減小，P21蛋白表達(dá)值(IHS值)則隨藥物劑量的增大而逐漸增加。對(duì)于每種蛋白，比較其處理組和對(duì)照組的IH

11、S值，均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。 結(jié)論： 1、Gen在一定劑量范圍內(nèi)能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性。 2、Gen抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期于G2//M期有關(guān)，該作用呈一定的劑量依賴性。 3、Gen抗結(jié)腸癌作用機(jī)制可能與下調(diào)PCNA、VEGF蛋白，上調(diào)P21蛋白的表達(dá)有關(guān)。 4、Gen具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用，為結(jié)腸癌治療及化學(xué)預(yù)防提供了