金雀異黃素的抗腫瘤及與輻照聯合效應作用機制的研究.pdf

1、背景：大豆異黃酮是富含于大豆中的植物雌激素,其中金雀異黃素(Genistein)生物活性最強。體內外研究均證實大豆異黃酮能減少激素依賴性腫瘤乳腺癌和前列腺癌發(fā)病率,是一種很有前景的防治癌癥的天然化學物質。已知激素替代療法有助于降低絕經女性結腸癌的發(fā)病風險,因此開展對植物雌激素的大豆異黃酮在結腸癌中的防治作用的研究具有重要的意義。另外,作為腫瘤的放射治療在臨床上可聯合應用手術、化學或激素治療,為了提高局部控制以及生存期,放療聯合放射增敏試

2、劑是一種針對癌癥的有效的治療方法,大豆異黃酮在其中所起的作用也值得關注。
　　目的：研究大豆異黃酮對結腸癌和乳腺癌的抗癌作用及大豆異黃酮對結腸癌和乳腺癌的輻射增敏作用。
　　方法：細胞株選用人結腸癌細胞 HCT-116和乳腺癌細胞 MDA-MB-468,細胞于DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)傳代。除非特別交代,金雀異黃素的實驗濃度定為0、25、50和100μmol/L。采用MTT法測定細胞存活率、流式細胞術分析細胞周期的分布、Wes

3、tern blot法測定相關蛋白的表達、磷脂酰絲氨酸外翻法(Annexin V-PI雙染法)分析金雀異黃素對細胞凋亡的影響;細胞內ROS的影響(DCF法)和線粒體膜電位的變化(JC-1法)采用試劑盒檢測;采用透射電鏡下觀察細胞超微結構的改變;金雀異黃素對腫瘤細胞的侵襲轉移的影響,采用Transwell實驗、細胞粘附性實驗以及免疫熒光法測定E-鈣粘附蛋白(E-cadherin)和基質金屬蛋白酶(MMP2)的變化進行研究。金雀異黃素對腫瘤細

4、胞放射敏感性的初步研究選用無毒性25μmol/L的金雀異黃素處理細胞,聯合 X射線對細胞進行輻照。采用克隆形成實驗計算細胞存活分數、流式細胞術檢測細胞周期和細胞的凋亡、并用Western blot法進一步檢測金雀異黃素預處理對照射后細胞內DNA損傷修復相關蛋白表達的調節(jié)作用。
　　結果：⑴金雀異黃素對HCT-116細胞增殖有明顯的抑制作用,并呈濃度和時間依賴關系,抑制50％細胞生長的劑量(IC50)為123.8μmol/L(24

5、h)。0、25、50和100μmol/L金雀異黃素處理后出現了明顯的G2/M的周期阻滯,細胞數量從18.11±1.36％增至32.7±0.04％。進一步的機制研究發(fā)現,金雀異黃素處理降低了細胞周期蛋白CyclinB1、CyclinH表達,對CylinD3、CyclinA、CyclinE的表達無明顯影響。⑵金雀異黃素處理HCT-116細胞后,Annexin V/PI雙染法結果顯示早期凋亡細胞比例隨濃度增加而上升,晚期凋亡細胞也略有增多。特

6、征性的Sub-G1凋亡峰隨處理濃度的增加而增多。100μmol/L金雀異黃素處理2 h后細胞內ROS水平達峰值,為處理前的1.81倍(15.53±1.55％vs8.57±0.35％),然后逐漸下降。100μmol/L金雀異黃素處理1h后線粒體膜電位迅速下降了87.8％,以后雖略有回升,但維持在極低的水平。與凋亡相關的P53蛋白出現升高,并且抑凋亡蛋白Bcl-2出現了下調,促凋亡蛋白 Bax出現了上調。透射電鏡下,金雀異黃素處理后細胞呈現

7、不同程度的凋亡和自噬性改變。⑶100μmol/L金雀異黃素處理8h后細胞粘附性為81.32±3.26％,對照組為97.31±7.68％,即金雀異黃素顯著降低粘附能力。Transwell結果顯示0、25、50μmol/L金雀異黃素處理后轉移細胞數分別為567.67±50、407±15.58、63.33±11.15,即侵襲轉移能力逐步下降。熒光顯微鏡下100μmol/L金雀異黃素處理后細胞質中E-cadherin熒光強度變強,MMP2抗體熒

8、光強度變弱。⑷金雀異黃素對MDA-MB-468細胞增殖也有明顯的抑制作用并具有濃度和時間依賴關系,IC50為70.8μmol/L(24 h)。0、25、50μmol/L金雀異黃素處理后G2/M期細胞數量從10.04±0.74％增至50.21±1.47％,100μmol/L時減至19.55±7.13％,表明低濃度時(<50μmol/L)引起G2/M期阻滯。⑸Annexin V/PI雙染法分析顯示100μmol/L金雀異黃素處理后晚期凋亡細

9、胞有所增加。特征性的Sub-G1凋亡峰隨著處理濃度的增加而增多。100μmol/L金雀異黃素處理后2 h,ROS水平是處理前的1.44倍(84.8±2.69％vs58.93±0.67％),然后逐漸下降。100μmol/L金雀異黃素處理1h后細胞線粒體膜電位迅速下降了93.7％(16.03±0.52％ vs1.01±0.20％, P<0.01),以后維持在極低的水平。透射電鏡下,處理后細胞也呈現不同程度的凋亡性改變。⑹100μmol/L金

10、雀異黃素處理6h后細胞粘附性為93.45±0.90％,顯著低于對照組的99.21±0.58％。Transwell結果顯示0、25、50μmol/L金雀異黃素處理后轉移細胞數分別為546.33±20.07、449.67±14.38、305.67±8.06,提示侵襲轉移能力明顯下降。熒光顯微鏡下,100μmol/L金雀異黃素處理后細胞質中 NF-κB抗體熒光強度稍變弱,細胞質中 E-cadherin抗體熒光強度變強、MMP2抗體熒光強度變弱

11、。⑺在人結腸癌HCT-116細胞中,與單純照射組6Gy組比較,25μmol/L金雀異黃素預處理照射聯合組,能明顯減少照射后的細胞克隆形成數,其放射增敏比為1.204。細胞周期的結果顯示25μmol/L金雀異黃素與6Gy輻射聯合后G2/M期細胞上升至35.74±3.25％,與單純照射組26.26±2.19％相比有明顯升高。特征性的Sub-G1凋亡峰,單純照射組為:5.25±0.8％,聯合組為10.89±0.24％。機制研究發(fā)現金雀異黃素與

12、輻射聯合較單純照射組比 DNA損傷修復蛋白 Ku80、Mre11和XRCC4的表達出現了明顯下調。⑻在乳腺癌MDA-MB-468細胞中,25μmol/L金雀異黃素與6Gy輻射聯合組和6Gy照射組的G2/M期細胞分別為82.41±2.44％和24.08±2.87％,發(fā)現金雀異黃素預處理能夠明顯引起細胞G2/M期周期阻滯。特征性的Sub-G1凋亡峰,單純照射組為:7.24±0.68％,聯合組為13.3±0.74％。但是,在MDA-MB-46

13、8細胞的Ku80、XRCC4、Mre11蛋白水平無明顯差異。
　　結論：①金雀異黃素能夠抑制結腸癌HCT-116和乳腺癌MDA-MB-468細胞的增殖,并呈濃度依賴和時間依賴。金雀異黃素誘導了這兩種腫瘤細胞的G2/M期周期阻滯。誘導細胞內ROS的產生,從而引起線粒體膜電位的降低誘導細胞凋亡。②其抗腫瘤的作用機制可能是金雀異黃素能夠下調抑凋亡蛋白Bcl-2的表達,上調促凋亡蛋白 Bax等的表達誘導了細胞的凋亡,引起細胞周期蛋白的改變