抗Ⅳ型膠原抗體偶聯(lián)金雀異黃素抑制后發(fā)障的研究.pdf

1、本文研究目的：制備抗Ⅳ型膠原抗體-金雀異黃素偶聯(lián)物，檢測(cè)偶聯(lián)物抗體活性及藥物的活性，評(píng)價(jià)其對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的抑制作用。為導(dǎo)向藥物治療在眼內(nèi)應(yīng)用提供理論依據(jù)。 研究方法： 第一部分：金雀異黃素抑制體外人晶狀體上皮細(xì)胞增殖的研究。 1、細(xì)胞培養(yǎng)凍存的人晶狀體上皮細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10％的胎牛血清100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及1.9g/LHEPES的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

2、，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 2、MTT測(cè)定不同濃度組金雀異黃素不同時(shí)間對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞增殖的抑制作用。 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度組金雀異黃素在24h、48h、72h對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞周期及凋亡的影響。 4、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)不同濃度組金雀異黃素作用人晶狀體上皮細(xì)胞48h后人晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)P21、P53、CyclinD1 mRNA表達(dá)情況。 5、免疫印跡(western blot)檢測(cè)不同濃度組金雀異黃

3、素作用人晶狀體上皮細(xì)胞48h后人晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)P21、P53、CyclinD1蛋白表達(dá)情況。 第二部分：抗Ⅳ型膠原抗體一金雀異黃素偶聯(lián)物制備提純及檢測(cè)。 1、抗Ⅳ型膠原抗體與金雀異黃素通過(guò)活性酯法偶聯(lián)。 2、抗Ⅳ型膠原抗體．金雀異黃素偶聯(lián)物的提純及檢測(cè)。 3、免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)偶聯(lián)物中抗體活性。 第三部分：抗Ⅳ型膠原抗體一金雀異黃素偶聯(lián)物體外抑制人晶狀體上皮細(xì)胞增殖的研究。 1、倒置顯

4、微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，偶聯(lián)物作用人晶狀體上皮細(xì)胞，觀察48h內(nèi)細(xì)胞形態(tài)變化，并拍攝細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 2、丫啶橙染色觀察細(xì)胞凋亡情況。 3、MTT法分析偶聯(lián)物作用人晶狀體上皮細(xì)胞12、24、48h對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞增殖抑制作用。 研究結(jié)果： 1、繪制了人晶狀體上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，傳代后3-5天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 2、不同濃度的金雀異黃素可抑制LECs增殖，在0-75mg/L范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系，并隨時(shí)間的延

5、長(zhǎng)，抑制效應(yīng)增強(qiáng)。質(zhì)量濃度為75 mg/L的金雀異黃素作用12 h對(duì)hLEC抑制作用與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)，作用24 h、48 h質(zhì)量濃度為12.5、25、50、75 mg/L的金雀異黃素對(duì)LEC抑制作用與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，72 h組各質(zhì)量濃度的金雀異黃素對(duì)LEC抑制作用與對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 3、隨Gen濃度的增大，G<,1>-S期細(xì)胞明顯增多。金雀異黃素作用24 h誘導(dǎo)凋

6、亡不明顯；在48 h組，質(zhì)量濃度為12.5 mg/L處理組出現(xiàn)凋亡峰，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到50.0 mg/L時(shí)凋亡明顯；處理72 h，6.25 mg/L質(zhì)量濃度組即可誘導(dǎo)凋亡，25mg/L質(zhì)量濃度組凋亡達(dá)51.83％，50 mg/L質(zhì)量濃度組凋亡達(dá)59.3％。 4、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，隨Gen濃度逐漸增高，晶狀體上皮細(xì)胞P21mRNA的表達(dá)逐漸下調(diào)，而CyclinD<,1>的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，而對(duì)照組及不同濃度Gen處理組p

7、53的mRNA均有表達(dá)，處理組與對(duì)照組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但各處理組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 5、Western blot法檢測(cè)結(jié)果：隨Gen作用濃度增加P21蛋白表達(dá)逐漸減少，CyclinD<,1>蛋白表達(dá)水平逐漸增高，P53蛋白表達(dá)處理組與對(duì)照組之間表達(dá)有顯著差異(P<0.05)，但各處理組間無(wú)顯著差異。 6、抗Ⅳ型膠原抗體與金雀異黃素通過(guò)活性酯法成功偶聯(lián)，本研究偶聯(lián)產(chǎn)物中抗Ⅳ型膠原抗體與金雀異黃素克分子比為1∶439，偶聯(lián)物與

8、晶狀體囊膜可特異結(jié)合。 7、丫啶橙染色觀察經(jīng)偶聯(lián)物作用24h、48h后的細(xì)胞均發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)改變。 8、偶聯(lián)物作用人晶狀體上皮細(xì)胞12、24、48h對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞增殖均有抑制作用，抑制率分別為28.5％、50.3％和76.9％。 研究結(jié)論： 1、金雀異黃素能夠抑制人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖，這種抑制是通過(guò)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡共同作用的結(jié)果。 2、采用活性酯法可成功地將抗Ⅳ型膠原抗體與金雀異黃素