金雀異黃素對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS增殖、凋亡及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 研究金雀異黃素(genistein，Gen)對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(collagen typeⅡinduced arthritis，CIA)大鼠關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)增殖、凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　 研究對(duì)象：
　　 CIA大鼠關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞
　　 方法：
　　 首先，采用Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑(com

2、plete Freund's adjuvant，CFA)共同建立CIA大鼠模型，對(duì)大鼠每周進(jìn)行一次關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評(píng)分及后肢容積測(cè)定。于造模第六周攝取關(guān)節(jié)X線片，然后處死大鼠，取大鼠后肢關(guān)節(jié)進(jìn)行關(guān)節(jié)滑膜組織病理檢測(cè)，并取出關(guān)節(jié)滑膜組織，用膠原酶消化法分離培養(yǎng)原代FLS；采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)FLS活性，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)Gen對(duì)FLS細(xì)胞增殖的影響，免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)Gen作用C

3、IA大鼠關(guān)節(jié)FLS細(xì)胞后其凋亡蛋白bax和bcl-2的表達(dá)情況；Western Blot檢測(cè)MAPK和PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中ERK、AKT和其磷酸化形式p-ERK、p-AKT蛋白的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1、Ⅱ型膠原致敏后三天，大鼠開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹，AI評(píng)分逐漸增高，至造模后第三周最為明顯。通過觀察AI評(píng)分、后肢容積測(cè)定、關(guān)節(jié)X線片以及關(guān)節(jié)滑膜組織病理發(fā)現(xiàn)，造模組與空白對(duì)照組比較有顯著性差異。表明造模成功，

4、可滿足本實(shí)驗(yàn)需要。原代培養(yǎng)CIA大鼠滑膜細(xì)胞，培養(yǎng)至第4代細(xì)胞形態(tài)均一。
　　 2、經(jīng)顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)臺(tái)盼藍(lán)染色FLS活細(xì)胞率大于90％，活性滿足實(shí)驗(yàn)要求。MTT結(jié)果顯示，造模后CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS增殖程度明顯高于正常組大鼠關(guān)節(jié)FLS，50、100和200μM的Gen均可以顯著抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS增殖，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，且在不同時(shí)間段均呈劑量依賴性抑制作用。200μM的Gen作用于CIA大鼠關(guān)節(jié)

5、FLS后，其增殖程度低于正常組FLS的增殖，其中，在72h時(shí)間段，兩組比較有顯著性差異(P＜0.05)。Western Blotting檢測(cè)凋亡蛋白水平結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)FLS細(xì)胞bax蛋白表達(dá)水平明顯降低，而模型組大鼠關(guān)節(jié)FLS細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá)水平較正常組大鼠關(guān)節(jié)FLS細(xì)胞明顯增高，均有顯著性差異(P＜0.05)；與模型組比較，不同濃度的Gen作用細(xì)胞后，隨著藥物濃度的增加，bax蛋白表達(dá)均有不同水平的上調(diào)，

6、其中Gen中劑量組(Gen2)和高劑量組(Gen3)與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，低劑量組(Gen1)與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)；用藥組bcl-2蛋白表達(dá)均有不同水平的下調(diào)，與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 3、Western blot檢測(cè)MAPK和PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號(hào)蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示：1)與正常組比較，模型組及用藥組EKR、AKT表達(dá)量均無明顯差異(P＞0.05)；

7、模型組FLS細(xì)胞p-ERK和p-AKT表達(dá)量高于正常組，且有顯著性差異(P＜0.05)；各Gen用藥組FLS細(xì)胞p-ERK蛋白的表達(dá)均低于正常組，有顯著性差異(P＜0.05)，且p-ERK表達(dá)的降低與Gen呈劑量依賴性。各Gen用藥組FLS細(xì)胞p-AKT蛋白的表達(dá)均高于正常組，Gen1和Gen2組與正常組比較有顯著性差異(P＜0.05)，Gen3組與正常組p-AKT表達(dá)相當(dāng)(P＞0.05)。2)與模型組FLS比較，各用藥組ERK、AKT

8、表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)；不同濃度Gen用藥組FLS細(xì)胞p-ERK、p-AKT蛋白的表達(dá)均低于模型組，均有顯著性差異(P＜0.05)，且p-ERK、p-AKT表達(dá)的降低與Gen呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 1、本實(shí)驗(yàn)CIA大鼠模型構(gòu)建成功，并成功分離培養(yǎng)了原代大鼠關(guān)節(jié)FLS。
　　 2、Gen能夠抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS細(xì)胞的增殖，同時(shí)，可調(diào)節(jié)凋亡蛋白的表達(dá)，可能通過此機(jī)制促進(jìn)CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS的凋