生命早期炎癥對(duì)驚厥易感性及相關(guān)腦損傷的影響.pdf

1、研究背景
　　癲癇(epilepsy)是一種大腦神經(jīng)元發(fā)作性異常放電引起的，以反復(fù)癇樣發(fā)作(seizure)為特征的臨床癥候群，是常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病。驚厥以強(qiáng)直或陣攣等骨骼肌運(yùn)動(dòng)性發(fā)作為主要表現(xiàn)，常伴意識(shí)障礙。由于驚厥是癇性發(fā)作的常見形式，常常被當(dāng)做癇性發(fā)作的同義詞。兒童及成人癲癇發(fā)病率高，長(zhǎng)期反復(fù)癇性發(fā)作會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的腦損傷甚至持久性精神行為障礙，給患者本人、家庭及社會(huì)造成很大的困擾。癲癇的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，大量研究表明，癲

2、癇發(fā)病與神經(jīng)遞質(zhì)失衡、離子通道、遺傳及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞異常有著密切關(guān)系。近年來(lái)，關(guān)于癲癇的病因、發(fā)病機(jī)制及治療等的研究工作取得了很大進(jìn)展，但是癲癇發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制尚未完全闡明。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成成分，與大腦的發(fā)育、正常生理活動(dòng)、神經(jīng)病理過(guò)程、以及損傷與修復(fù)有著密切的聯(lián)系。神經(jīng)炎癥主要以膠質(zhì)細(xì)胞（特別是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）活化、增生并分泌促炎癥細(xì)胞因子如白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子

3、α(TNFα)、白介素-6(IL-16)及抗炎細(xì)胞因子白介素-10（IL-10）等為特點(diǎn)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究數(shù)據(jù)表明大腦炎癥反應(yīng)參與癲癇發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。許多研究顯示癲癇發(fā)病過(guò)程中伴有小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化增生與大量促炎癥細(xì)胞因子生成。適度的神經(jīng)炎癥是大腦應(yīng)對(duì)損傷的保護(hù)性反應(yīng)。然而，過(guò)度持續(xù)膠質(zhì)細(xì)胞活化及其產(chǎn)生的大量促炎細(xì)胞因子不僅可使血腦屏障完整性被破壞，通透性增加，促進(jìn)炎癥細(xì)胞進(jìn)一步浸潤(rùn)，也可使神經(jīng)元興奮性增高，升高驚厥

4、易感性并能加劇癲癇打擊導(dǎo)致的腦損傷。因此，過(guò)度持續(xù)大腦炎癥反應(yīng)與癲癇發(fā)作互為因果，促進(jìn)癲癇的發(fā)生發(fā)展。
　　近年來(lái)，大量研究表明，生命早期炎癥不僅可導(dǎo)致急性腦損傷更可對(duì)大腦、心理及行為發(fā)育產(chǎn)生長(zhǎng)遠(yuǎn)影響。胎兒發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期子宮微環(huán)境的紊亂可導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)、功能和發(fā)育異常，增加生后罹患神經(jīng)、精神及行為障礙的風(fēng)險(xiǎn)。臨床上，母親孕期病毒或細(xì)菌感染均與后代孤獨(dú)癥、精神分裂癥及腦癱的發(fā)生有關(guān)。例如，前瞻性流行病學(xué)研究顯示母親孕期弓形蟲、生殖系感染

5、及感冒均可使得后代精神分裂癥發(fā)病危險(xiǎn)性增高。此外，新生兒期炎癥刺激也可導(dǎo)致代謝、免疫及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生長(zhǎng)期功能性改變，增加青少年期甚至成年后神經(jīng)精神疾病及行為障礙易感性。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)制作母體免疫激活(maternalimmuneactivation，MIA)嚙齒類動(dòng)物模型來(lái)測(cè)定孕期感染對(duì)后代的生理及行為效應(yīng)。在這些研究中，常通過(guò)給孕鼠注射脂多糖(LPS)或人工合成的雙鏈RNA聚肌胞苷酸(polyI∶C)，以刺激孕鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，來(lái)

6、分別模擬母體細(xì)菌或病毒感染。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的主要組成成分，可通過(guò)與某些細(xì)胞表面的Toll樣受體4(toll-likereceptor-4，TLR4)及TLR2結(jié)合，激活核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)，從而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。在MIA模型中，孕期LPS刺激可使得孕鼠血清、胎盤及羊水中促炎細(xì)胞因子mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)。大劑量LPS甚至可導(dǎo)致胎鼠大腦炎性細(xì)胞因子表達(dá)升高。另外，有研究顯示大鼠

7、孕期及新生兒期暴露于LPS可導(dǎo)致大腦海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化一直持續(xù)到成年期。由于大腦炎癥反應(yīng)可促進(jìn)癲癇發(fā)生發(fā)展，我們推測(cè)孕期及新生兒期炎癥刺激可能會(huì)增加兒童期及成年期驚厥易感性。
　　與我們的推測(cè)相符，近年來(lái)，流行病學(xué)調(diào)查資料證實(shí)母親妊娠期巨細(xì)胞病毒感染、陰道酵母菌感染、膀胱炎、持續(xù)性咳嗽大于7天及持續(xù)性腹瀉大于4天均可增加后代兒童期癲癇發(fā)病危險(xiǎn)性。母親產(chǎn)時(shí)感染也可升高新生兒驚厥易感性。最近國(guó)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠新生

8、兒期炎癥刺激可增加成年期驚厥易感性。然而，孕期感染能否增加后代兒童期及成年期驚厥易感性，生命早期炎癥能否加劇癲癇打擊造成的腦損傷，能否導(dǎo)致長(zhǎng)期腦發(fā)育及行為異常及其可能的機(jī)制，至今，未有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道。對(duì)上述問(wèn)題的深入研究，有助于進(jìn)一步闡明癲癇及其相關(guān)腦損傷的發(fā)病機(jī)制，為其臨床防治提供新的思路。
　　第一章孕晚期免疫激活對(duì)子代青少年大鼠驚厥易感性的影響
　　研究目的:
　　研究母體孕晚期免疫激活對(duì)子代青少年大鼠驚厥易感性及

9、相關(guān)腦損傷的影響及其可能的機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.孕晚期免疫激活模型的建立
　　給予雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠在孕齡19天及20天時(shí)，連續(xù)兩天腹腔注射脂多糖(LPS)，每次300ug/kg，以構(gòu)建孕晚期免疫激活大鼠模型;對(duì)照組孕鼠腹腔注射相同容積的生理鹽水(NS)。觀察兩組孕鼠的分娩時(shí)間、產(chǎn)仔量及新生仔鼠出生體重。
　　2.子代青少年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的建立
　　選用生后21天(

10、postnatalday21，P21)的雄性子代青少年大鼠并隨機(jī)分組。將海人酸(kainicacid，KA)按照7.5mg/kg給予癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus，SE)組大鼠腹腔注射，觀察大鼠行為變化。癇性發(fā)作行為學(xué)評(píng)價(jià)根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:0級(jí):正常行為狀態(tài);Ⅰ級(jí):凝視、咀嚼、動(dòng)須或頭面部輕微顫動(dòng);Ⅱ級(jí):點(diǎn)頭、甩尾、搔抓，濕狗樣抖動(dòng);Ⅲ級(jí):一側(cè)前肢局限性陣攣;Ⅳ級(jí):伴后肢站立的全身強(qiáng)直性陣

11、攣發(fā)作;Ⅴ級(jí):出現(xiàn)站立并摔倒的全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作。持續(xù)觀察大鼠行為，記錄發(fā)作的等級(jí)及出現(xiàn)時(shí)間。持續(xù)全身發(fā)作或連續(xù)多次全身發(fā)作之間不能恢復(fù)正常狀態(tài)超過(guò)30min者為SE(Ⅳ-Ⅴ級(jí))。在SE開始后2小時(shí)給予水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射終止發(fā)作。僅發(fā)作達(dá)Ⅳ或Ⅴ級(jí)的大鼠納入后續(xù)試驗(yàn)。未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的子代大鼠予以剔除。對(duì)照組青少年大鼠給予腹腔注射相同容積的NS。子代大鼠腹腔注射觀察行為變化后送回至原母鼠籠。
　　這樣，腹腔注射KA或NS

12、的青少年大鼠已經(jīng)被隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組(NS-NS)，生前炎癥組(LPS-NS)，海人酸致癇組(NS-KA)和“二次打擊”組(LPS-KA)。
　　3.驚厥易感性測(cè)定
　　海人酸注射后，首次癲癇發(fā)作開始時(shí)間(seizureonsettime，SOT)作為癲癇發(fā)作的潛伏期。我們將大鼠前肢局限性陣攣、后肢站立或身體失衡作為首次癇性行為。本研究中，我們用SOT來(lái)衡量青少年大鼠對(duì)海人酸的驚厥易感性。
　　4.SE后6h，隨

13、機(jī)選擇各組大鼠，采用實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-timepolymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)，檢測(cè)炎性因子IL-1β、TNFα、IL-6及IL-10表達(dá)情況。
　　5.SE后24h及3d時(shí)，隨機(jī)選擇各組大鼠，分別采用Westernblot方法及免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，離子鈣接頭蛋白分子1(Iba1)和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，膠原纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)變化。
　　6.

14、SE后3d，隨機(jī)選擇各組大鼠，采用NeuN免疫組織化學(xué)染色、尼氏染色和FJB染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及損傷情況。
　　7.在P70時(shí)，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測(cè)定各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力。
　　8.Morris水迷宮測(cè)試后，采用曠場(chǎng)試驗(yàn)測(cè)定各組大鼠自發(fā)活動(dòng)水平及探索能力。
　　結(jié)果:
　　1.孕期脂多糖刺激對(duì)孕鼠分娩時(shí)間、產(chǎn)仔量及子代鼠體重的影響。
　　暴露于LPS組孕鼠與NS注射組孕鼠在分娩時(shí)

15、間及產(chǎn)仔量上無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。LPS暴露組新生鼠平均出生體重較NS注射組顯著減低。此外，LPS暴露組子代鼠P9體重也較NS注射組子代鼠顯著減低。LPS刺激組及NS注射組子代鼠P21體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.孕期暴露于LPS導(dǎo)致子代鼠青少年期KA所致驚厥易感性增加。
　　腹腔注射KA后，LPS暴露組子代鼠(LPS-KA)SOT較NS注射組子代鼠(NS-KA)SOT縮短，表明孕期LPS刺激可導(dǎo)致子代鼠青少年期KA所致驚厥易感性

16、增加。
　　3.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后6小時(shí)，各組大鼠海馬炎癥因子的表達(dá)情況。
　　RT-PCR定量分析結(jié)果顯示:
　　(1)生前炎癥組(LPS-NS)IL-1βmRNA、TNFαmRNA、IL-6mRNA及IL-10mRNA的表達(dá)與正常對(duì)照組(NS-NS)無(wú)顯著差異;
　　(2)KA致癇組(NS-KA)IL-1βmRNA、TNFαmRNA、IL-6mRNA及IL-10mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組(NS-NS)均

17、增高;
　　(3)與NS-KA組相比，LPS-KA組IL-1βmRNA及IL-6mRNA表達(dá)增高;然而，IL-10mRNA與TNFαmRNA的表達(dá)在LPS-KA組與NS-KA組間無(wú)差異。
　　4.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后，各組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況
　　Westernblot與免疫組化染色均顯示，與NS-NS組相比，LPS-NS組、NS-KA組大鼠海馬Iba1蛋白表達(dá)水平升高;與NS-KA組相比，LPS-KA組大鼠

18、海馬Iba1蛋白表達(dá)水平升高。Iba1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期活化，并能加劇KA所致海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。
　　5.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后，各組大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況
　　Westernblot與免疫組化染色均顯示，與NS-NS組相比，LPS-NS組、NS-KA組大鼠海馬GFAP蛋白表達(dá)水平升高;與NS-KA組相比，LPS-KA組大鼠海馬GFAP蛋白表達(dá)水平升高。GFAP蛋白表

19、達(dá)結(jié)果顯示:生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期活化，并能加劇KA所致海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。
　　6.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后3天，各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷情況
　　尼氏染色顯示NS-NS組大鼠海馬CA1區(qū)無(wú)神經(jīng)元損傷，形態(tài)正常。LPS-NS組、NS-KA組及LPS-KA組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為尼氏染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，形態(tài)異常。與NS-KA組相比，LPS-KA組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷加重。尼氏染

20、色結(jié)果表明生前炎癥刺激可產(chǎn)生長(zhǎng)期效應(yīng):生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后海馬神經(jīng)元損傷，并能加劇KA所致海馬神經(jīng)元損傷。
　　NeuN與FJB染色結(jié)果同尼氏染色結(jié)果相似。
　　7.P70時(shí)，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶情況
　　在Morris水迷宮尋找隱藏平臺(tái)的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練進(jìn)展，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短。與NS-NS組相比，LPS-NS組及NS-KA組大鼠尋找到平臺(tái)的潛伏期明顯增長(zhǎng)。與NS-KA組

21、相比，LPS-KA組大鼠尋找到平臺(tái)的潛伏期明顯增長(zhǎng)。
　　在Morris水迷宮探索試驗(yàn)中，與NS-NS組相比，LPS-NS組與NS-KA組大鼠目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比明顯縮短。與NS-KA組相比，LPS-KA組大鼠目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比明顯縮短。
　　8.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠自發(fā)活動(dòng)水平及探索能力表現(xiàn)情況
　　曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)自發(fā)活動(dòng)結(jié)果顯示，各組大鼠水平穿越方格數(shù)及豎直站立次數(shù)無(wú)明顯不同。
　　探索行為結(jié)果顯示，LPS-

22、NS組大鼠與NS-NS組大鼠間點(diǎn)頭次數(shù)無(wú)明顯差別。與NS-NS組大鼠相比，NS-KA組大鼠點(diǎn)頭次數(shù)減少。LPS-KA組大鼠比NS-KA組大鼠點(diǎn)頭次數(shù)減少，表明LPS-KA組大鼠比NS-KA組大鼠探索能力降低。
　　結(jié)論:
　　1.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代鼠青少年期海人酸所致驚厥易感性增加;
　　2.孕期炎癥刺激可增加驚厥所致青少年子代鼠海馬神經(jīng)元損傷、惡化神經(jīng)炎癥應(yīng)答并能加劇驚厥所致空間學(xué)習(xí)記憶能力及探索能力損害;

23、>　　3.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致青少年子代鼠海馬神經(jīng)元損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期活化，但對(duì)海馬區(qū)炎癥因子表達(dá)無(wú)影響;
　　4.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代鼠成年期空間學(xué)習(xí)及記憶能力損害;
　　綜上所述，生前炎癥刺激可能通過(guò)啟動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期活化以致驚厥所致腦損傷加劇。
　　第二章孕期感染增加氯化鋰-匹羅卡品所致子代成年大鼠驚厥易感性
　　研究目的:
　　研究孕期感染對(duì)氯化鋰-匹羅卡品所致子代成年

24、大鼠驚厥易感性及相關(guān)腦損傷的影響。
　　研究方法:
　　1.孕期免疫激活模型的建立
　　雌性wistar大鼠在孕齡15及16天時(shí)，連續(xù)兩天腹腔注射脂多糖(LPS)，每次200ug/kg，構(gòu)建孕期免疫激活大鼠模型;對(duì)照組孕鼠腹腔注射相同容積的生理鹽水(NS)。
　　2.子代年輕成年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型(SE)的建立
　　選用生后45天(postnatalday45，P45)的雄性子代年輕成年大鼠并隨機(jī)分組。腹

25、腔注射氯化鋰(LiCl，127mg/kg)后，將匹羅卡品(pilocarpine，Pilo)按照36mg/kg給予SE組大鼠腹腔注射，觀察大鼠行為變化。癇性發(fā)作行為學(xué)評(píng)價(jià)根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見本研究第一章摘要部分）。持續(xù)觀察大鼠行為，記錄發(fā)作的等級(jí)及出現(xiàn)時(shí)間。在SE開始后1小時(shí)給予水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作。僅發(fā)作達(dá)Ⅳ或Ⅴ級(jí)的大鼠納入后續(xù)試驗(yàn)。未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的子代大鼠予以剔除。對(duì)照組成年大鼠腹腔注射相同

26、容積的NS。
　　這樣，腹腔注射Pilo或NS的子代成年大鼠已經(jīng)被隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組(NS-NS)，生前炎癥組(LPS-NS)，氯化鋰-匹羅卡品(LiPC)致癇組(NS-LiPC)和“二次打擊”組(LPS-LiPC)。
　　3.驚厥易感性測(cè)定
　　LiPC注射后，首次癇性行為發(fā)作的潛伏期作為癇性發(fā)作開始時(shí)間(seizureonsettime，SOT)。我們將大鼠前肢局限性陣攣、后肢站立或身體失衡作為首次癇性行為。

27、本研究中，我們用SOT來(lái)衡量年輕成年大鼠對(duì)LiPC的驚厥易感性。
　　4.SE后3天，隨機(jī)選擇各組大鼠，采用尼氏染色觀察大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及損傷情況。
　　5.P61時(shí)，采用曠場(chǎng)試驗(yàn)測(cè)定各組大鼠自發(fā)活動(dòng)水平及探索能力。
　　6.P68時(shí)，采用高架迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組大鼠焦慮水平。
　　7.P75時(shí)，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測(cè)定各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力。
　　結(jié)果:
　　1.孕期暴露于

28、LPS導(dǎo)致子代鼠成年期LiPC所致驚厥易感性增加。
　　腹腔注射LiPC后，LPS暴露組子代鼠(LPS-LiPC)SOT較NS注射組子代鼠(NS-LiPC)SOT縮短，表明孕期LPS刺激可導(dǎo)致子代鼠成年期LiPC所致驚厥易感性增加。
　　2.LiPC誘導(dǎo)P45大鼠SE后3天，各組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元損傷情況。
　　尼氏染色顯示NS-NS組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常，無(wú)損傷。LPS-NS組、NS-L

29、iPC組及LPS-LiPC組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為CA1及CA3區(qū)尼氏染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，形態(tài)異常。與NS-LiPC組相比，LPS-LiPC組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元損傷加重。尼氏染色結(jié)果表明生前炎癥刺激可產(chǎn)生長(zhǎng)期效應(yīng):生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后成年期大腦海馬神經(jīng)元損傷，并能加劇驚厥所致海馬神經(jīng)元損傷。
　　3.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠自發(fā)活動(dòng)水平及探索能力表現(xiàn)情況。
　　曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)自發(fā)活動(dòng)結(jié)果顯示，各組大鼠間水平穿越

30、方格數(shù)及豎直站立次數(shù)無(wú)明顯不同。
　　探索行為結(jié)果顯示，LPS-NS組與NS-NS組之間及NS-LiPC組與NS-NS組之間點(diǎn)頭次數(shù)均無(wú)明顯差別。LPS-LiPC組比NS-LiPC組點(diǎn)頭次數(shù)減少，表明LPS-LiPC組大鼠比NS-LiPC組大鼠探索能力降低。
　　4.各組大鼠在高架迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)情況。
　　高架迷宮實(shí)驗(yàn)中，用焦慮分?jǐn)?shù)來(lái)反映焦慮程度。結(jié)果顯示，LPS-NS組焦慮分?jǐn)?shù)低于NS-NS正常對(duì)照組，表明生前炎癥

31、刺激導(dǎo)致大鼠生后成年期焦慮水平升高。此外，NS-LiPC組焦慮分?jǐn)?shù)高于NS-NS組。LPS-LiPC組與NS-LiPC組大鼠間焦慮分?jǐn)?shù)無(wú)明顯差異。
　　5.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶情況。
　　在Morris水迷宮尋找隱藏平臺(tái)的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練進(jìn)展，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物逃避潛伏期逐漸縮短。與NS-NS組相比，LPS-NS組、NS-LiPC組及LPS-LiPC組大鼠尋找到平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)。與NS-LiPC

32、組相比，LPS-LiPC組大鼠尋找到平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)。
　　此外，在Morris水迷宮探索試驗(yàn)中，與NS-NS組相比，LPS-NS組、NS-LiPC組及LPS-LiPC組大鼠目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比明顯縮短。NS-LiPC組與LPS-LiPC組目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比無(wú)明顯不同。
　　結(jié)論:
　　1.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代鼠成年期LiPC所致驚厥易感性增高;
　　2.孕期炎癥刺激可增加驚厥所致成年子代鼠海馬神經(jīng)元

33、損傷;
　　3.孕期炎癥刺激可加劇驚厥所致空間學(xué)習(xí)及探索能力損害。
　　4.孕期炎癥刺激可升高子代鼠成年期焦慮水平并導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)及記憶能力損害;
　　綜上所述，生前炎癥刺激可增加生后成年期驚厥易感性并加劇驚厥所致腦損傷。
　　第三章新生兒期炎癥增加驚厥所致成年大鼠海馬依賴性記憶損傷
　　研究目的:
　　研究新生兒期免疫應(yīng)激能否導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生長(zhǎng)期改變并探索這種變化對(duì)成年期癲癇發(fā)作所致神經(jīng)行為結(jié)果的影

34、響。
　　研究方法:
　　1.新生兒期免疫激活模型的建立
　　給予雄性SD大鼠在生后第3天(postnatalday3，P3)及P5，腹腔注射脂多糖(LPS)，每次50ug/kg，構(gòu)建新生兒期免疫激活大鼠模型;對(duì)照組新生鼠腹腔注射相同容積的生理鹽水(NS)。
　　2.免疫熒光法測(cè)定新生兒期LPS刺激對(duì)海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　分別在P5注射LPS或NS后4天(P9)、16天(P21)及40天(P45)時(shí)處

35、死大鼠，取海馬組織。運(yùn)用離子鈣接頭蛋白分子1（Iba1，小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物）免疫熒光染色研究LPS刺激所致小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的時(shí)程變化。
　　3.在P3注射LPS或NS后，連續(xù)6天給予新生鼠腹腔注射米諾環(huán)素(minocycline)或磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。新生鼠分為3組:SS組（正常對(duì)照組），LS組（新生兒期LPS刺激并PBS處理組）和LM組（新生兒期LPS刺激并米諾環(huán)素處理組）。分別在P9及P21時(shí)處死大鼠，運(yùn)用Iba1免疫熒光染

36、色研究米諾環(huán)素對(duì)LPS所致小膠質(zhì)細(xì)胞變化的抑制效應(yīng)。
　　4.以下設(shè)計(jì)以研究新生兒期LPS暴露能否對(duì)成年期海人酸（KA）所致神經(jīng)行為結(jié)果產(chǎn)生影響，并探究米諾環(huán)素在其中的作用。新生兒期注射NS或LPS的大鼠PBS或米諾環(huán)素處理后，在P45時(shí)腹腔注射KA，以誘導(dǎo)癲癇發(fā)作。此研究共分4組:正常對(duì)照組(SSS)，成年致癇組(SSK)，“二次打擊”組(LSK)，及“二次打擊”米諾環(huán)素治療組(LMK)。具體方法如下:
　　(1)子代年輕

37、成年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)模型的建立
　　P45時(shí)，將KA按照15mg/kg給予SE組大鼠腹腔注射，觀察大鼠行為變化。癇性發(fā)作行為學(xué)評(píng)價(jià)根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見第一部分。本研究中，我們?nèi)杂冒B性發(fā)作開始時(shí)間(seizureonsettime，SOT)來(lái)衡量年輕成年大鼠對(duì)KA所致癲癇發(fā)作易感性。在SE開始后2小時(shí)給予大鼠水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射終止發(fā)作;
　　(2)SE后6h，隨機(jī)選擇各組大鼠，

38、采用實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(Real-timepolymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)，檢測(cè)炎性因子IL-1β及TNFα表達(dá)情況;
　　(3)SE后3天，隨機(jī)選擇各組大鼠，采用Iba1染色觀察海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況;
　　(4)從P46至P55，隨機(jī)選擇各組大鼠，運(yùn)用Y-迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠海馬依賴性空間學(xué)習(xí)情況;
　　(5)Y-迷宮實(shí)驗(yàn)后，從P60至P65，運(yùn)用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠海馬依賴

39、性空間學(xué)習(xí)及記憶情況;
　　(6)水迷宮實(shí)驗(yàn)后，在P70，隨機(jī)選擇各組大鼠，運(yùn)用抑制回避實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠海馬依賴性非空間記憶情況。
　　結(jié)果
　　1.新生兒期暴露于LPS對(duì)成年期KA所致驚厥易感性無(wú)影響。
　　腹腔注射KA后，SSK、LSK及LMK大鼠間SOT無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明新生兒期LPS刺激對(duì)成年期KA所致驚厥易感性無(wú)影響。
　　2.新生兒期LPS免疫應(yīng)激導(dǎo)致海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生較長(zhǎng)時(shí)間活化。
　

40、　Iba1免疫熒光染色顯示，新生兒期LPS暴露組大鼠在P9及P21，海馬區(qū)Iba1陽(yáng)性染色光密度(OD)值高于新生兒期NS注射組大鼠;但是在P45時(shí)，兩組大鼠Iba1陽(yáng)性染色OD值無(wú)差異。該結(jié)果顯示，新生兒期LPS免疫應(yīng)激導(dǎo)致海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生較長(zhǎng)時(shí)間活化至青少年時(shí)期。
　　3.米諾環(huán)素抑制LPS所致小膠質(zhì)細(xì)胞活化。
　　Iba1免疫熒光染色顯示，在P9及P21，LS組海馬區(qū)Iba1陽(yáng)性染色OD值高于LM與SS組;在P9及

41、P21，SS組與LM組Iba1陽(yáng)性染色OD值無(wú)差異。
　　4.SE后6h，各組大鼠炎性因子IL-1βmRNA及TNFαmRNA表達(dá)情況。
　　RT-PCR定量分析結(jié)果顯示:
　　(1)SSK、LSK及LMK組IL-1βmRNA較SSS組升高;LSK組IL-1βmRNA表達(dá)較SSK組及LMK組升高;SSK與LMK間，IL-1βmRNA表達(dá)水平無(wú)差異;
　　(2)SSK、LSK及LMK組TNFαmRNA較SSS組升高

42、;LSK組TNFαmRNA表達(dá)較SSK及LMK組升高;SSK與LMK間，TNFαmRNA表達(dá)水平無(wú)差異。
　　5.SE后3天，各組大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。
　　Iba1免疫熒光染色顯示:SSK、LSK及LMK組Iba1陽(yáng)性染色OD值較SSS組升高;LSK組Iba1陽(yáng)性染色OD值較SSK及LMK組升高;SSK與LMK間，Iba1蛋白表達(dá)水平無(wú)差異;
　　6.從P46至P55，各組大鼠Y-迷宮實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)情況。
　

43、　Y-迷宮實(shí)驗(yàn)中，自發(fā)交替反應(yīng)率越高表示大鼠學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示SSK、LSK及LMK組自發(fā)交替反應(yīng)率低于SSS組;LSK組自發(fā)交替反應(yīng)率較SSK及LMK組降低，SSK與LMK間自發(fā)交替反應(yīng)率無(wú)差別。
　　7.從P60至P65，各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)情況。
　　結(jié)果顯示:在Morris水迷宮尋找隱藏平臺(tái)的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間學(xué)習(xí)能力無(wú)明顯差異。
　　在探索試驗(yàn)中，SSK、LSK及LMK組目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比低

44、于SSS組，LSK組目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比較SSK及LMK組降低，SSK與LMK間目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間百分比無(wú)差別。
　　8.P70時(shí)，各組大鼠抑制回避實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)情況。
　　抑制回避實(shí)驗(yàn)中，暗室逃避潛伏期越長(zhǎng)反映大鼠海馬依賴性非空間記憶力越好。結(jié)果顯示:訓(xùn)練后1小時(shí)，LSK組暗室逃避潛伏期較SSS組明顯縮短;SSS、LMK及SSK組之間，暗室逃避潛伏期無(wú)明顯差異。訓(xùn)練后24小時(shí)，LSK組暗室逃避潛伏期較SSS、SSK及LMK組明顯