利用二次打擊驚厥模型探討生酮飲食和褪黑素長程干預(yù)對新生期驚厥性腦損傷的影響及機制.pdf

1、第一部分、制作二次打擊驚厥模型
　　目的：選用三氟乙醚和青霉素制作二次打擊驚厥模型（two-hit seizure model），觀察驚厥大鼠的行為變化特點，并記錄驚厥閾及存活率。
　　方法：取日齡8天(Postnatal days8，P8)的Sprague-Dawley(SD)大鼠共120只，依據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分為對照組和驚厥組，每組各60只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1天后，于P9天，驚厥組大鼠反復(fù)吸入三氟乙醚誘導驚厥發(fā)作，每日5次，

2、每次間隔30分鐘，同樣方法連續(xù)誘導13天；對照組同樣操作但不吸入三氟乙醚。于P63天，分別對兩組大鼠腹腔注射青霉素（5.1×106U/kg/d）直至驚厥發(fā)作，連續(xù)觀察1小時，記錄自腹腔注射后首次出現(xiàn)驚厥發(fā)作的時間，即驚厥潛伏期（即驚厥閾），觀察驚厥大鼠行為變化特點，并計算大鼠的存活率。
　　結(jié)果：利用三氟乙醚和青霉素成功建立了二次打擊驚厥模型，結(jié)果顯示：腹腔注射青霉素后，與對照組（31.46±7.13 min）相比，三氟乙醚致驚厥

3、組大鼠的驚厥潛伏期（13.67±5.65 min）明顯縮短（P＜0.01），即驚厥閾值明顯降低；并且驚厥組大鼠的存活率（55％）遠低于對照組（存活率為75%）。
　　結(jié)論：
　　1.繼三氟乙醚誘導新生期反復(fù)驚厥模型，于P63天采用青霉素誘導第二次驚厥發(fā)作，成功建立二次打擊驚厥模型。
　　2.P63天腹腔注射青霉素后，可使三氟乙醚致驚厥組大鼠的驚厥閾明顯降低，且表現(xiàn)出較低的存活率。
　　第二部分、生酮飲食長程干預(yù)對

4、新生期驚厥性腦損傷遠期神經(jīng)行為和苔蘚纖維發(fā)芽的影響及機制
　　目的：探討生酮飲食長程干預(yù)對新生期驚厥性腦損傷遠期神經(jīng)行為和苔蘚纖維發(fā)芽的影響及機制。
　　方法：生后8天(P8)的SD大鼠共60只，依據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分為單純對照組(NS+ND組)、對照加生酮飲食組(NS+KD組)、單純驚厥組(RS+ND組)、驚厥加生酮飲食組(RS+KD組)，每組各15只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1天后，于P9天，RS+ND組和RS+KD組大鼠反復(fù)吸入三氟

5、乙醚誘導驚厥發(fā)作，每日5次，每次間隔30分鐘，同樣方法連續(xù)誘導13天；對NS+ND組和NS+KD組同樣操作但不吸入三氟乙醚。于P23天開始，NS+KD組和RS+KD組大鼠給予生酮飲食(KD)，NS+ND組和RS+ND組大鼠給予普通飲食（ND），飲食干預(yù)30天。于P33、P43、P53分別進行神經(jīng)反射實驗。于P54～P60行Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力。于P61、P62行曠場實驗檢測大鼠的認知情緒功能。于P63，對各組大鼠腹

6、腔注射青霉素后，觀察大鼠行為變化并記錄驚厥閾及存活率，同時測血酮值和血糖值。隨后，每組隨機取5只，共20只，斷頭取腦，采用Timm染色法觀察海馬苔蘚纖維異常發(fā)芽程度。每組隨機取5只，共20只，斷頭取海馬大腦皮質(zhì)，采用免疫印跡技術(shù)（Western blot）檢測各組大鼠海馬及大腦皮質(zhì)ZIP7、ApoA1、cPLA2、P53、P62蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.對體重的影響：生酮飲食干預(yù)期間（P23-P53），四組大鼠的體重

7、變化有總體性差異（P＜0.01），兩兩比較結(jié)果顯示：于P23-P53，RS+ND組和RS+KD組大鼠各時間點體重較NS+ND組均顯著降低（P＜0.01）；于P26-P53，NS+KD組大鼠各時間點體重較NS+ND組顯著降低（P＜0.01）；于P29-P53，RS+KD組大鼠各時間點體重較RS+ND組顯著降低（P＜0.01）。
　　2.神經(jīng)反射實驗：⑴平面翻正時間：P33天四組大鼠平面翻正時間無顯著性差異[F(3,16)=0.51，

8、P=0.682＞0.05]；P43天四組大鼠平面翻正時間有顯著性差異，且差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=19.95，P＜0.0001]，進一步兩兩比較，RS+ND組的平面翻正時間較NS+ND組明顯縮短（P＜0.05），其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；P53天四組大鼠平面翻正時間有顯著性差異，且差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=7.23，P=0.003＜0.01]，進一步兩兩比較，驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD

9、組的平面翻正時間較RS+ND組明顯延長（P＜0.05），其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。⑵前肢懸吊時間：P33天四組大鼠前肢懸吊時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=6.3，P=0.005＜0.01]。進一步兩兩比較，RS+ND組的前肢懸吊時間較NS+ND組明顯縮短（P＜0.05），其余各組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。P43天四組大鼠前肢懸吊時間無顯著性差異[F(3,16)=0.34，P=0.797＞

10、0.05]。P53天四組大鼠前肢懸吊時間無顯著性差異[F(3,16)=1.5，P=0.252＞0.05]。⑶負向趨地反應(yīng)時間：P33天四組大鼠負向趨地反應(yīng)時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=10.68，P=0.0004＜0.01]。進一步兩兩比較，RS+ND組和RS+KD組的負向趨地反應(yīng)時間較NS+ND組均明顯延長（P＜0.05），其余各組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。P43天四組大鼠負向趨地反應(yīng)時間存在顯著性差異

11、，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=52.06，P＜0.0001]，進一步兩兩比較，RS+ND組、RS+KD組和NS+KD組的負向趨地反應(yīng)時間較NS+ND組均明顯延長（P＜0.05），而驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組的負向趨地反應(yīng)時間較RS+ND組明顯縮短（P＜0.05）。P53天四組大鼠負向趨地反應(yīng)時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=13.98，P＜0.0001]，進一步兩兩比較，RS+ND組的負向趨地

12、反應(yīng)時間較NS+ND組明顯延長（P＜0.05），而驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組的負向趨地反應(yīng)時間較RS+ND組明顯縮短（P＜0.05），RS+KD組與NS+ND組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常。⑷懸崖回避時間：P33天四組大鼠懸崖回避時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=28.09，P＜0.0001]。進一步兩兩比較，RS+ND組的懸崖回避時間較NS+ND組明顯延長（P＜0.05）；而驚厥組大

13、鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組的懸崖回避時間較RS+ND組明顯縮短（P＜0.05），RS+KD組與NS+ND組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常。P43天四組大鼠懸崖回避時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=43.68，P＜0.0001]，進一步兩兩比較，RS+ND組的懸崖回避時間較NS+ND組明顯延長（P＜0.05）；而驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組的懸崖回避時間較RS+ND組明顯縮短（P＜

14、0.05），RS+KD組與NS+ND組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常。P53天四組大鼠懸崖回避時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義（F(3,16)=31.07，P＜0.0001），進一步兩兩比較，RS+ND組和NS+KD組的懸崖回避時間較NS+ND組明顯延長（P＜0.05），而驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組的懸崖回避時間較RS+ND組明顯縮短（P＜0.05），RS+KD組與NS+ND組比較無顯著性差異（P＞0.

15、05），趨于正常。
　　3. Morris水迷宮：⑴定位航行實驗：四組大鼠水迷宮逃避潛伏期存在組間顯著性差異[F(3,12)=156.6，P<0.0001]，訓練天數(shù)顯著性差異[F(4,16)=63.33，P<0.0001]以及組間因素與訓練天數(shù)的交互作用的顯著性差異[F(12,48)=4.650，P<0.0001]，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)：實驗第1天至第5天，RS+ND組逃避潛伏期較NS+ND組均明顯延

16、長（P＜0.05）。實驗第2天至第5天，驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組逃避潛伏期較RS+ND組均明顯縮短（P＜0.05），RS+KD組與NS+ND組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常。此外，NS+KD組逃避潛伏期較NS+ND組均明顯延長（P＜0.05）。⑵空間探索實驗：四組大鼠穿越平臺次數(shù)比較存在顯著性差異[F(3,16)=12.41，P=0.0002]，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，RS+ND

17、組和NS+KD組大鼠穿越平臺次數(shù)較NS+ND組均明顯減少（P＜0.05），而驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組較RS+ND組明顯增多（P＜0.05），RS+KD組與NS+ND組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常。
　　4.曠場實驗：⑴延遲時間：四組大鼠曠場實驗延遲時間存在組間顯著性差異[F(3,12)=101.7，P<0.0001]，及組間因素與訓練天數(shù)的交互作用的顯著性差異[F(3,12)=7.116，P=0.

18、0053]，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而訓練天數(shù)間無顯著性差異[F(1,4)=5.213，P=0.0845]。兩兩比較發(fā)現(xiàn)：與NS+ND組相比，RS+ND組和NS+KD組的延遲時間（P61、P62）均明顯延長（P＜0.05）；與RS+ND組相比，驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組大鼠的延遲時間（P61、P62）明顯縮短（P＜0.05），RS+KD組與NS+ND組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常。⑵開場得分：

19、四組大鼠曠場實驗開場得分存在組間顯著性差異[F(3,12)=35.72，P<0.0001]，及訓練天數(shù)顯著性差異[F(1,4)=74.17，P=0.001]，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而組間因素與訓練天數(shù)的交互作用無顯著性差異[F(3,12)=3.41，P=0.0531]。兩兩比較發(fā)現(xiàn)：與NS+ND組相比，RS+ND組和NS+KD組的開場得分（P61、P62）均明顯降低（P＜0.05）；與RS+ND組相比，驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食

20、長程干預(yù)后即RS+KD組大鼠的開場得分（P61、P62）明顯升高（P＜0.05），RS+KD組與NS+ND組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常。
　　5.Timm染色結(jié)果顯示：RS+ND組CA3區(qū)始層和齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維發(fā)芽程度較NS+ND組顯著升高（P＜0.01），而驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組CA3區(qū)始層和齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維發(fā)芽程度較RS+ND組明顯降低（P＜0.05），RS+KD組與NS+ND

21、組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常。
　　6.驚厥閾及存活率結(jié)果顯示：⑴驚厥閾：與NS+ND組相比，RS+ND組和RS+KD組大鼠的驚厥閾明顯降低（P＜0.05），而與RS+ND組相比，驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組大鼠的驚厥閾明顯升高（P＜0.05），其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。⑵存活率：NS+ND組（73.3%）、NS+KD組（60%）、RS+ND組（46.7%）、RS+KD組（73.

22、3%）。
　　7.Western blot顯示：⑴海馬：與NS+ND組相比，RS+ND組ZIP7、ApoA1、P53、P62在海馬中的表達均明顯升高（P＜0.05），cPLA2在海馬中的表達明顯降低（P＜0.05）；RS+KD組P53在海馬中的表達明顯降低（P＜0.05）。而與RS+ND組相比，驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)后即RS+KD組ZIP7、ApoA1、P53、P62在海馬中的表達均明顯降低（P＜0.05），cPLA2在海馬

23、中的表達明顯升高（P＜0.05）；對于ZIP7、ApoA1、P62、cPLA2在海馬中的表達，RS+KD組與NS+ND組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常。其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。⑵大腦皮質(zhì)：與NS+ND組相比，RS+ND組ZIP7、ApoA1、P53、P62在大腦皮質(zhì)中的表達均明顯升高（P＜0.05），cPLA2在大腦皮質(zhì)中的表達明顯降低（P＜0.05）；而與RS+ND組相比，驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食長程干預(yù)

24、后即RS+KD組ZIP7、ApoA1、P53、P62在大腦皮質(zhì)中的表達均明顯降低（P＜0.05），cPLA2在大腦皮質(zhì)中的表達明顯升高（P＜0.05），其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.生酮飲食長程干預(yù)對新生期驚厥性腦損傷遠期神經(jīng)行為、認知、苔蘚纖維發(fā)芽、驚厥閾、存活率等有干預(yù)作用，即生酮飲食長程干預(yù)可減輕遠期神經(jīng)行為、認知的損傷、抑制海馬苔蘚纖維異常發(fā)芽，提高驚厥閾和存活率。
　　2

25、.生酮飲食長程干預(yù)，能顯著下調(diào)新生期驚厥導致的ZIP7、ApoA1、P53、P62在海馬及大腦皮質(zhì)表達的升高，上調(diào)cPLA2表達的降低。
　　3.本研究采用二次打擊驚厥模型初步表明，生酮飲食長程干預(yù)可能通過鋅-脂質(zhì)過氧化-自噬信號通路發(fā)揮對新生期驚厥性腦損傷的神經(jīng)保護作用。
　　第三部分、褪黑素長程干預(yù)對新生期驚厥性腦損傷遠期神經(jīng)行為和苔蘚纖維發(fā)芽的影響及機制
　　目的：探討褪黑素長程干預(yù)對新生期驚厥性腦損傷遠期神經(jīng)行

26、為和苔蘚纖維發(fā)芽的影響及機制。
　　方法：生后8天(P8)的SD大鼠共60只，依據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分為單純對照組(CONT組)、褪黑素空白對照組(MEL組)、單純驚厥組(RS組)、驚厥加褪黑素組(RS+MEL組)，每組各15只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1天后，于P9天，RS組和RS+MEL組大鼠反復(fù)吸入三氟乙醚誘導驚厥發(fā)作，每日5次，每次間隔30分鐘，同樣方法連續(xù)誘導13天；對CONT組和MEL組同樣操作但不吸入三氟乙醚。自P23始對MEL組和

27、RS+MEL組于每天早上8點以10mg/kg腹腔注射MEL，同時CONT組和RS組以同時同等劑量腹腔注射5%乙醇溶液,連續(xù)注射30d。于P33、P43、P53分別進行神經(jīng)反射實驗。于P54～P60行Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力。于P61、P62行曠場實驗檢測大鼠的認知情緒功能。于P63，對各組大鼠腹腔注射青霉素后，觀察大鼠行為變化并記錄驚厥閾及存活率，隨后，每組隨機取5只，共20只，斷頭取腦，采用Timm染色觀察海馬苔蘚纖

28、維異常發(fā)芽的程度。每組隨機取5只，共20只，斷頭取海馬和大腦皮質(zhì)，采用免疫印跡技術(shù)（Western blot）檢測各組大鼠海馬及大腦皮質(zhì)ZnT1、ZIP7、ApoA1、cPLA2、P53、P62、Beclin1、Bcl-2、LC3Ⅱ/Ⅰ、CathepsinE蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.神經(jīng)反射實驗：⑴平面翻正時間：P33天四組大鼠平面翻正時間無顯著性差異[F(3,16)=2.518，P=0.095＞0.05]；P43天

29、四組大鼠平面翻正時間有顯著性差異，且差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=8.241，P=0.0015＜0.01]，進一步兩兩比較，RS組和 RS+MEL組的平面翻正時間較CONT組均明顯縮短（P＜0.05），其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；P53天四組大鼠平面翻正時間有顯著性差異，且差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=4.622，P=0.0164＜0.05]，進一步兩兩比較，RS組的平面翻正時間較CONT組明顯縮短（P＜0.0

30、5），其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。⑵前肢懸吊時間：P33天四組大鼠前肢懸吊時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=9.238，P=0.0009＜0.01]。進一步兩兩比較，RS組的前肢懸吊時間較CONT組明顯縮短（P＜0.05），其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。P43天四組大鼠前肢懸吊時間有顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=8.544，P=0.0013＜0.01]。進一步兩兩比較

31、，RS組的前肢懸吊時間較CONT組明顯縮短（P＜0.05），其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。P53天四組大鼠前肢懸吊時間有顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=7.642，P=0.0022＜0.01]。進一步兩兩比較，RS組的前肢懸吊時間較CONT組明顯縮短（P＜0.05），而驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組的前肢懸吊時間較RS組明顯延長（P＜0.05），RS+MEL組與CONT組比較無顯著性差異（P＞

32、0.05），趨于正常。⑶負向趨地反應(yīng)時間：P33天四組大鼠負向趨地反應(yīng)時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=27.07，P＜0.0001]。進一步兩兩比較，與CONT組相比，RS組和RS+MEL組的負向趨地反應(yīng)時間均明顯延長（P＜0.05）；而與RS組相比，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組的負向趨地反應(yīng)時間均明顯縮短（P＜0.05）；此外，與MEL組相比，RS組和RS+MEL組的負向趨地反應(yīng)時間均明顯延長（P

33、＜0.05）。P43天四組大鼠負向趨地反應(yīng)時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=73.44，P＜0.0001]，進一步兩兩比較，與CONT組相比，RS組和RS+MEL組的負向趨地反應(yīng)時間均明顯延長（P＜0.05）；而與RS組相比，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組的負向趨地反應(yīng)時間均明顯縮短（P＜0.05）；此外，與MEL組相比，RS組和RS+MEL組的負向趨地反應(yīng)時間均明顯延長（P＜0.05）。P53天四組大

34、鼠負向趨地反應(yīng)時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=154.2，P＜0.0001]，進一步兩兩比較，與CONT組相比，RS組和RS+MEL組的負向趨地反應(yīng)時間均明顯延長（P＜0.05）；而與RS組相比，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組的負向趨地反應(yīng)時間均明顯縮短（P＜0.05）；此外，與MEL組相比，RS組和RS+MEL組的負向趨地反應(yīng)時間均明顯延長（P＜0.05）。⑷懸崖回避時間：P33天四組大鼠懸崖回避時

35、間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=175.8，P＜0.0001]。進一步兩兩比較，與CONT組相比，RS組和RS+MEL組的懸崖回避時間均明顯延長（P＜0.05）；與MEL組相比，RS組和RS+MEL組的懸崖回避時間均明顯延長（P＜0.05），其余各組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。P43天四組大鼠懸崖回避時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=61.89，P＜0.0001]，進一步兩兩比較，與CONT

36、組相比，RS組和RS+MEL組的懸崖回避時間均明顯延長（P＜0.05）；而與RS組相比，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組的懸崖回避時間明顯縮短（P＜0.05）。此外，與MEL組相比，RS組和RS+MEL組的懸崖回避時間均明顯延長（P＜0.05）。P53天四組大鼠懸崖回避時間存在顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義[F(3,16)=114.6，P＜0.0001]，進一步兩兩比較，與CONT組相比，RS組和RS+MEL組的懸崖回避時間均

37、明顯延長（P＜0.05）；而與RS組相比，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組的懸崖回避時間明顯縮短（P＜0.05）。此外，與MEL組相比，RS組和RS+MEL組的懸崖回避時間均明顯延長（P＜0.05）。
　　2. Morris水迷宮：⑴定位航行實驗：四組大鼠水迷宮逃避潛伏期存在組間顯著性差異[F(3,12)=71.29，P<0.0001]，訓練天數(shù)顯著性差異[F(4,16)=153.7，P<0.0001]以及組間因素與訓

38、練天數(shù)的交互作用的顯著性差異[F(12,48)=4.258，P=0.0001]，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），兩兩比較發(fā)現(xiàn)：實驗第1天至第5天，RS組逃避潛伏期較CONT組均明顯延長（P＜0.05）。實驗第2天至第5天，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組逃避潛伏期較RS組均明顯縮短（P＜0.05），實驗第2天，與CONT組比較，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05）。在實驗第3

39、至第5天，RS+MEL組與CONT組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常。⑵空間探索實驗：四組大鼠穿越平臺次數(shù)比較存在顯著性差異[F(3,16)=28.53，P＜0.0001]，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，RS組和RS+MEL組大鼠穿越平臺次數(shù)較CONT組均明顯減少（P＜0.05），而驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組大鼠穿越平臺次數(shù)較RS組明顯增多（P＜0.05），其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P

40、＞0.05）。
　　3.曠場實驗：⑴延遲時間：四組大鼠曠場實驗延遲時間存在組間顯著性差異[F(3,12)=117.6，P<0.0001]，及訓練天數(shù)顯著性差異[F(1,4)=1184，P<0.0001]，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而組間因素與訓練天數(shù)的交互作用無顯著性差異[F(3,12)=0.5514，P=0.6568＞0.05]。兩兩比較發(fā)現(xiàn)：與CONT組相比，RS組延遲時間（P61、P62）明顯延長（P＜0.05）；

41、而與RS組相比，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組大鼠的延遲時間（P61、P62）明顯縮短（P＜0.05），而RS+MEL組與CONT組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常，其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。⑵開場得分：四組大鼠曠場實驗開場得分存在組間顯著性差異[F(3,12)=238.3，P<0.0001]，及組間因素與訓練天數(shù)的交互作用顯著性差異[F(3,12)=4.866，P=0.0193]，差異具有統(tǒng)

42、計學意義（P＜0.05），而訓練天數(shù)無顯著性差異[F(1,4)=0.045，P=0.8416＞0.05]。兩兩比較發(fā)現(xiàn)：與CONT組相比，RS組和RS+MEL組的開場得分（P61、P62）均明顯降低（P＜0.05）；與RS組相比，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組大鼠的開場得分（P61、P62）明顯升高（P＜0.05）其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　4.驚厥閾及存活率結(jié)果顯示：⑴驚厥閾：與CONT組相

43、比，RS組和RS+MEL組大鼠的驚厥閾明顯降低（P＜0.05），而與RS組相比，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組大鼠的驚厥閾明顯升高（P＜0.05）。此外，與MEL組相比，RS組和RS+MEL組大鼠的驚厥閾明顯降低（P＜0.05）。⑵存活率：CONT組（80%）、MEL組（87%）、RS組（46.7%）、RS+MEL組（53.3%）。
　　5.Timm染色結(jié)果顯示：單純驚厥組（RS組）CA3區(qū)始層和齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖

44、維發(fā)芽程度較單純對照組（CONT組）顯著升高（P＜0.01），而驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組 CA3區(qū)始層和齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維發(fā)芽程度較單純驚厥組（RS組）明顯降低（P＜0.05），而RS+MEL組與CONT組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常，其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　6.Western blot顯示：⑴海馬：與CONT組相比，RS組ZIP7、ApoA1、P53、P62、Be

45、clin1、Beclin1/Bcl-2、LC3Ⅱ/Ⅰ、CathepsinE在海馬中的表達均明顯升高（P＜0.05），ZnT1、cPLA2、Bcl-2在海馬中的表達明顯降低（P＜0.05）；而與RS組相比，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組ZIP7、ApoA1、P53、P62、Beclin1、Beclin1/Bcl-2、LC3Ⅱ/Ⅰ、CathepsinE在海馬中的表達均明顯降低（P＜0.05），ZnT1、cPLA2、Bcl-2在

46、海馬中的表達明顯升高（P＜0.05），而RS+MEL組與CONT組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常，其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。⑵大腦皮質(zhì)：與CONT組相比，RS組ZIP7、ApoA1、P53、P62在大腦皮質(zhì)中的表達均明顯升高（P＜0.05），ZnT1、cPLA2、Bcl-2在大腦皮質(zhì)中的表達明顯降低（P＜0.05）；而與RS組相比，驚厥組大鼠經(jīng)褪黑素長程干預(yù)后即RS+MEL組ZIP7、ApoA1、P53、

47、P62、Beclin1、Beclin1/Bcl-2、LC3Ⅱ/Ⅰ、CathepsinE在大腦皮質(zhì)中的表達均明顯降低（P＜0.05），ZnT1、cPLA2、Bcl-2在大腦皮質(zhì)中的表達明顯升高（P＜0.05），而RS+MEL組與CONT組比較無顯著性差異（P＞0.05），趨于正常，其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.褪黑素長程干預(yù)對新生期驚厥性腦損傷遠期神經(jīng)行為、認知、海馬苔蘚纖維異常發(fā)芽、驚厥

48、閾和存活率有干預(yù)作用，即褪黑素長程干預(yù)可減輕遠期神經(jīng)行為、認知的損傷，抑制海馬苔蘚纖維異常發(fā)芽，提高驚厥閾和存活率。
　　2.褪黑素長程干預(yù)能顯著下調(diào)新生期驚厥導致的ZIP7、ApoA1、P53、P62、Beclin1、Beclin1/Bcl-2、LC3Ⅱ/Ⅰ、CathepsinE在海馬及大腦皮質(zhì)表達的升高，上調(diào)ZnT1和cPLA2、Bcl-2表達的降低。
　　3.本研究采用二次打擊驚厥模型初步表明，褪黑素長程干預(yù)可能通過鋅