生酮飲食對新生期反復(fù)驚厥遠(yuǎn)期神經(jīng)行為損傷及發(fā)芽相關(guān)分子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：探討生酮飲食對三氟乙醚所致新生期反復(fù)驚厥大鼠遠(yuǎn)期神經(jīng)行為損傷和海馬苔蘚纖維再生性發(fā)芽相關(guān)分子表達(dá)的影響。
　　方法：出生8天(Postnatal days8，用P8表示，下同)的Sprague-Dawley(SD)大鼠共48只，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組（Non-seizure， NS組)和驚厥組(Recurrent-seizure，RS組)，每組各24只。適應(yīng)性喂養(yǎng)一天后，RS組大鼠于P9吸入三氟乙醚誘導(dǎo)驚厥發(fā)作，反復(fù)

2、誘導(dǎo)驚厥持續(xù)30min，每日一次，同樣方法連續(xù)誘導(dǎo)8天；NS組同樣操作但不吸入三氟乙醚。于P28依據(jù)是否給予生酮飲食干預(yù)，每組大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法再隨機(jī)分為兩組，即單純對照組(NS+ND組)、對照加生酮飲食組(NS+KD組)、單純驚厥組(RS+ND組)、驚厥加生酮飲食組(RS+KD組)，每組各12只。NS+ND組和RS+ND組大鼠給予普通飲食（Normal diet，ND），NS+KD組和RS+KD組大鼠給予生酮飲食(Ketogenic

3、 diet，KD)，飲食干預(yù)四周。分別于P28、P35、P42、P49每組大鼠尾靜脈采血監(jiān)測其血糖值和血酮值。飲食干預(yù)期間(P28～P49)每隔三天測量并記錄各組大鼠的體重。于P35、P42、P49分別進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分（平面翻正實(shí)驗(yàn)、前肢懸吊實(shí)驗(yàn)、負(fù)向趨地反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、懸崖回避實(shí)驗(yàn)）。于P42、P49行曠場實(shí)驗(yàn)測試大鼠的自主活動和情緒變化。于P50～P57行Morris水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。于P58每組各隨機(jī)取6只大鼠共24只，斷頭

4、取大腦皮質(zhì)及海馬，采用免疫印跡技術(shù)（Western blot）檢測各組大鼠大腦皮質(zhì)及海馬鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體3（Zn2+transporter3，ZnT3）、金屬硫蛋白3（Metallothionein-3，MT3）、載脂蛋白E(ApoE)、載脂蛋白J（ApoJ，又名叢生蛋白，Clusterin，CLU)、脂肪酰輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase-1，ACAT-1）

5、的表達(dá)。同時每組隨機(jī)各取6只大鼠共24只，采用Neo-Timm染色法觀測海馬苔蘚纖維發(fā)芽的程度及分布情況。
　　結(jié)果：1.對體重的影響：生酮飲食干預(yù)前，驚厥組（RS組）P17～P27各時間點(diǎn)體質(zhì)量較對照組（NS組）對應(yīng)時間點(diǎn)明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.01）；生酮飲食干預(yù)期間（P28～P49），四組大鼠的體重變化存在總體性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。進(jìn)一步組間兩兩比較結(jié)果顯示：與單純對照組（NS+ND組）各時間點(diǎn)相

6、比，對照組經(jīng)生酮飲食干預(yù)后（NS+KD組）及單純驚厥組（RS+ND組）大鼠各對應(yīng)時間點(diǎn)體重均顯著降低（P＜0.01）。于 P31～P49，驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食干預(yù)后(RS+KD組)體重較單純驚厥組（RS+ND組）顯著降低（P＜0.01）。
　　2.神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)：與單純對照組（NS+ND組）相比，單純驚厥組（RS+ND組）（P35、P42、P49）前肢懸吊時間、負(fù)向趨地反應(yīng)時間和懸崖回避時間均明顯延長（P＜0.05），平面翻正時間（

7、P35、P42、P49）明顯縮短（P＜0.05）。與單純驚厥組（RS+ND組）比較，驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食干預(yù)后(RS+KD組)（P35、P42、P49）前肢懸吊時間、負(fù)向趨地反應(yīng)時間和懸崖回避時間均明顯縮短（P＜0.05），平面翻正時間（P35、P49）明顯延長（P＜0.05）。此外，與單純對照組（NS+ND組）相比，對照組經(jīng)生酮飲食干預(yù)后（NS+KD組）（P35、P42、P49）前肢懸吊時間和負(fù)向趨地反應(yīng)時間均明顯延長（P＜0.05）

8、。
　　3.曠場實(shí)驗(yàn)：與單純對照組（NS+ND組）比較，單純驚厥組（RS+ND組）延遲時間（P42、P49）明顯延長（P＜0.05）、開場得分（P42、P49）明顯降低（P＜0.05）、修飾次數(shù)（P42、P49）明顯增多（P＜0.05）；而對照組經(jīng)生酮飲食干預(yù)后（NS+KD組）延遲時間（P49）明顯延長（P＜0.05），修飾次數(shù)（P42）明顯增多（P＜0.05）。與單純驚厥組（RS+ND組）比較，驚厥組經(jīng)生酮飲食干預(yù)后(RS+KD

9、組)延遲時間（P42、P49）明顯縮短（P＜0.05）、開場得分（P42、P49）明顯降低（P＜0.05）、修飾次數(shù)（P42、P49）明顯減少（P＜0.05）。
　　4.Morris水迷宮：⑴四組大鼠逃避潛伏期于測試第1天至第5天逐漸縮短，且于測試第1天至第5天，單純驚厥組（RS+ND組）逃避潛伏期較單純對照組（NS+ND組）明顯延長（P＜0.05）；于測試第4、5天驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食干預(yù)后(RS+KD組)逃避潛伏期較單純驚厥組

10、（RS+ND組）明顯縮短（P＜0.05）。⑵單純驚厥組（RS+ND組）穿越平臺次數(shù)較單純對照組（NS+ND組）明顯減少（P＜0.05）；驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食干預(yù)后(RS+KD組)穿越平臺次數(shù)較單純驚厥組（RS+ND組）明顯增多（P＜0.05）。
　　5.Neo-Timm染色結(jié)果顯示：單純驚厥組（RS+ND組）CA3區(qū)始層和齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維發(fā)芽程度較單純對照組（NS+ND組）顯著升高（P＜0.01），而驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食干預(yù)

11、后(RS+KD組) CA3區(qū)始層和齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維發(fā)芽程度較單純驚厥組（RS+ND組）明顯降低（P＜0.05）。
　　6.免疫印跡顯示：⑴鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)信號通路：與單純對照組（NS+ND組）相比，單純驚厥組（RS+ND組）ZnT3、MT3大腦皮層的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），在海馬中的表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；而與單純驚厥組（RS+ND組）相比，驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食干預(yù)后(RS+KD組) ZnT3、MT3在海馬和大腦皮

12、層的表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。單純對照組（NS+ND組）與對照組經(jīng)生酮飲食干預(yù)后（NS+KD組）和驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食干預(yù)后(RS+KD組)相比均無顯著性差異（P＞0.05）。⑵脂質(zhì)代謝信號通路：與單純對照組（NS+ND組）相比，單純驚厥組（RS+ND組）ApoE和ACAT-1在海馬和大腦皮層的表達(dá)均顯著升高（P＜0.01），CLU在海馬和大腦皮層的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）；而與單純驚厥組（RS+ND組）相比，驚厥組大鼠經(jīng)生

13、酮飲食干預(yù)后(RS+KD組) CLU和ACAT-1在海馬和大腦皮層的表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），ApoE在海馬中表達(dá)顯著降低（P＜0.01）而在大腦皮層中表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。單純對照組（NS+ND組）與對照組經(jīng)生酮飲食干預(yù)后（NS+KD組）和驚厥組大鼠經(jīng)生酮飲食干預(yù)后(RS+KD組)相比均無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：1.三氟乙醚誘導(dǎo)新生期大鼠反復(fù)長程驚厥發(fā)作導(dǎo)致生長發(fā)育、神經(jīng)行為及學(xué)習(xí)能力的損傷，造成海

14、馬CA3區(qū)始層及齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維異常發(fā)芽增強(qiáng)，并且這種改變可能與鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子ZnT3、MT3及脂質(zhì)代謝相關(guān)分子ApoE、CLU和ACAT-1在海馬及大腦皮質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào)有關(guān)。
　　2.驚厥后采用生酮飲食進(jìn)行干預(yù)，能顯著改善大鼠的神經(jīng)行為及認(rèn)知損傷，且這種保護(hù)作用可能與鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子ZnT3、MT3及脂質(zhì)代謝相關(guān)分子ApoE、CLU和ACAT-1在海馬及大腦皮質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào)有關(guān)。
　　3.本研究表明，鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)