人血漿中硒蛋白-P的純化及技術(shù)開發(fā)研究.pdf

1、硒蛋白-P是人血漿中的一種富硒蛋白，它的硒含量大約占據(jù)了人血漿中硒含量的50％。因此，硒蛋白-P的變化對(duì)人體血漿中的硒含量影響很大。硒蛋白-P最顯著的功能是作為人體內(nèi)硒的運(yùn)載體和具有細(xì)胞外抗氧化活性。據(jù)報(bào)道，人血漿中硒蛋白-P含量降低與克山病、白肌病、某些炎癥等密切相關(guān)。因此深入研究硒蛋白-P對(duì)于這些疾病的預(yù)防和診斷意義重大。
　　為了深入研究硒蛋白-P，必須首先獲得較高純度的硒蛋白-P樣品。由于硒蛋白-P在人體血漿中的含量很低，

2、平均水平為3.04mg/L。因此，從人血漿中分離純化硒蛋白-P對(duì)純化方法的特異性要求較高。已報(bào)道的獲取純度較高的人血漿中硒蛋白-P的有效方法是免疫親和色譜法，該方法的關(guān)鍵是得到能夠產(chǎn)生硒蛋白-P單克隆抗體的硒蛋白-P樣品。但是目前僅有的報(bào)道，采用四步色譜法從人血漿中獲得了能夠產(chǎn)生硒蛋白-P單克隆抗體的硒蛋白-P樣品，步驟繁瑣，回收率僅為4～8%。并且現(xiàn)在也沒有市售的硒蛋白-P單克隆抗體樣品，免疫親和色譜法的應(yīng)用受到限制。本研究的目的就是

3、開發(fā)一種有效的獲取硒蛋白-P樣品的方法，為硒蛋白-P單克隆抗體的制備提供足夠的原材料。
　　本課題開發(fā)建立了一種簡單、高效獲取硒蛋白-P樣品的方法。采用兩步連續(xù)親和色譜法：肝素-瓊脂糖凝膠和Ni-瓊脂糖凝膠色譜從人血漿中純化硒蛋白-P。考察了國產(chǎn)色譜填料和美國GE填料對(duì)硒蛋白-P的親和活性，最終選擇了親和活力較高的GE填料。完成了色譜梯度洗脫中最佳流動(dòng)相洗脫梯度的設(shè)置，最終建立了兩步親和色譜法純化人血漿中硒蛋白-P的方法。引入氫化

4、物發(fā)生-原子熒光分光光度法檢測硒含量，作為色譜過程中硒蛋白-P的檢測手段，跟蹤色譜純化過程，并完成該檢測方法的方法學(xué)考察，此方法靈敏度較高，方法準(zhǔn)確。選用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)色譜純化得到的硒蛋白-P樣品進(jìn)行定性和純度檢測，驗(yàn)證得到了一定純度的硒蛋白-P樣品。最后對(duì)色譜純化后得到的硒蛋白-P樣品進(jìn)行超濾、冷凍干燥等后處理最終得到了硒蛋白-P固體樣品。
　　本課題建立了完整的人血漿中硒蛋白-P的純化