NAC預(yù)處理人早胚間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)肺損傷修復(fù)作用的研究.pdf

1、背景和目的:急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一種嚴(yán)重的肺部炎性疾病，以急性彌漫性炎癥滲出開始，繼而迅速進(jìn)展為急性呼吸衰竭，晚期則發(fā)展為彌漫性纖維化。是臨床常見危重癥，病死率極高。目前治療主要包活保護性肺通氣策略、限制性液體管理和藥物治療。其中，保護性機械通氣的臨床應(yīng)用對近年ARDS死亡率的下降起到了重要作用。但是對于ARDS治療的藥物，目前臨床上應(yīng)用的效果并不十分確切肯定。因此，迫切需要一個治療ARDS的有效藥物。Friedenstei

2、n最早在1968年從骨髓中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，MSC是一群具有非吞噬性、克隆化和成纖維細(xì)胞樣生長的貼壁細(xì)胞，需在塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)獲得，具有高度的自我更新能力，體外擴增迅速。隨著研究的深入，MSC的來源日益增多，比如脂肪、胎盤等成體組織或者胚胎及胎兒組織。其中，胚胎組織來源的MSC在增殖和分化能力方面較成體來源的MSC更強，免疫原性弱，所以使用胚胎來源的MSC作為干細(xì)胞的研究具有其獨特的優(yōu)越性。研究發(fā)現(xiàn)，MSC在治療ARDS方面

3、具有非常廣泛的發(fā)展前景。MSC可以通過旁分泌作用釋放出一些可溶性的生長因子，來改善肺泡上皮細(xì)胞和肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)，減少組織損傷，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。但是隨著干細(xì)胞移植治療肺損傷的深入開展，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療的細(xì)胞移植率較為低下(＜1％)，因此限制了干細(xì)胞治療的效果?；钚匝?ROS)在肺損傷的發(fā)病機制中起了重要的作用，大量的ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。這些大量的ROS，可以影響移植干細(xì)胞的粘附和遷移。S

4、ong等研究發(fā)現(xiàn)通過使用ROS清除劑(N-乙酰半胱氨酸NAC)預(yù)處理MSC進(jìn)行干細(xì)胞移植治療心肌梗塞小鼠，可以提高M(jìn)SC的移植率，進(jìn)而促進(jìn)梗塞局部的組織修復(fù)，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，提高M(jìn)SC的治療效果。Drowley等發(fā)現(xiàn)NAC預(yù)處理肌肉來源的干細(xì)胞治療心肌梗塞小鼠可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的再生。而使用NAC抗氧化劑預(yù)處理的MSC治療肺損傷目前沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)類似的報道。本實驗旨在探討用抗氧化劑NAC預(yù)處理人早胚間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)，是否可以增強h

5、MSC的抗氧化能力，促進(jìn)細(xì)胞粘附和伸展，提高細(xì)胞生存率。使用NAC預(yù)處理hMSC后，是否可以加強hMSC移植治療博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的治療效果。
　　方法:從4-6周藥物引產(chǎn)胚胎中分離培養(yǎng)hMSC。流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD34和CD45。誘導(dǎo)hMSC向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分化，采用免疫組化方法分別檢測不同的特異性抗原表達(dá)。體外細(xì)胞實驗部分檢測hMSC細(xì)胞內(nèi)ROS、還原性谷胱

6、甘肽的含量，觀察分析hMSC細(xì)胞粘附和伸展情況。動物體內(nèi)實驗部分通過博萊霉素致小鼠肺損傷模型，采用HE染色、Masson染色、肺損傷病理評分、Ashcroft評分和肺組織羥脯氨酸的測定評價肺組織病理學(xué)改變;ELISA法測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-6、IL-1β和TNF-α含量;免疫熒光組織化學(xué)法觀察hMSC體內(nèi)定植、轉(zhuǎn)分化和肺內(nèi)增殖;TUNEL染色法檢測小鼠肺泡壁細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:hMSC陽性表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志

7、CD29、CD44和CD90。在不同的組織細(xì)胞分化培養(yǎng)條件下，可以誘導(dǎo)hMSC向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分化。用抗氧化劑NAC預(yù)處理hMSC后，促進(jìn)hMSC內(nèi)還原型谷胱甘肽的生成，增強了hMSCROS清除能力，促進(jìn)細(xì)胞粘附和伸展能力，增強hMSC抗氧化能力。使用NAC預(yù)處理的hMSC治療博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷后減輕了小鼠肺內(nèi)炎癥和纖維化病變程度，使BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α含量降低，小鼠肺泡壁細(xì)胞凋亡減少