銀杏葉提取物對酒精所致大鼠骨骼肌氧化凋亡損傷的保護及治療作用的研究.pdf

1、慢性酒精中毒性肌病(Chronic alcoholic myopathy，CAM)是由于長期酗酒引起的一種肌肉病，在嗜酒者中發(fā)病率約40％—60％，臨床主要表現(xiàn)為肌無力、肌痛和肌萎縮，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。有資料表明長期酗酒能夠引起骨骼肌氧化．抗氧化平衡失調(diào)以及骨骼肌細(xì)胞的過度凋亡。銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物(extract of Ginkgo biloba，EGb761)是從銀杏葉中提取的混合物(6％萜內(nèi)酯、24％黃酮苷)，研究表明其具有抗氧

2、化及抗凋亡作用。目前國內(nèi)外用銀杏葉提取物作為清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的藥物來治療心腦血管疾病等方面的報道很多，而在慢性酒精中毒性肌病中尚未見報道。在CAM患者日益增加的今天，對于該病發(fā)病機制及防治用藥的研究具有重要的社會意義。本實驗擬討論酒精導(dǎo)致的氧化損傷對骨骼肌凋亡的影響及其相關(guān)機制，并以此為切入點研究銀杏葉提取物防治CAM的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供理論及實驗依據(jù)。 目的： 本實驗從體內(nèi)及體外實驗兩個方面進(jìn)行研究。體

3、內(nèi)實驗擬在建立大鼠慢性酒精中毒性肌病模型的基礎(chǔ)上，同時采用EGb761預(yù)防及治療，以Ⅱ型肌纖維為主的跖肌為研究對象觀察大鼠骨骼肌組織氧化-抗氧化指標(biāo)，骨骼肌細(xì)胞的凋亡率，凋亡相關(guān)基因的變化以及肌肉組織病理學(xué)的改變，探討EGb761的保護及治療作用及其可能的作用機制。體外實驗擬在建立骨骼肌原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，給予無水乙醇及EGb761干預(yù)，觀察乙醇濃度及作用時間與骨骼肌細(xì)胞凋亡改變的關(guān)系，同時觀察EGb761對乙醇造成的骨骼肌細(xì)胞凋亡損

4、傷的保護作用。 方法： 體內(nèi)實驗： (1)選健康SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70只隨機分成四組(對照組，酒精組，治療組，預(yù)防配合治療組)，在建立慢性酒精中毒性大鼠肌病模型的基礎(chǔ)上給予Egb761進(jìn)行預(yù)防(96μg/g bw per day)及治療(192μg/g bw per day)，四組均喂飼改良的全營養(yǎng)高脂飼料，觀察實驗前后各組大鼠體重、行為學(xué)變化及肌肉組織病理學(xué)改變。 (2

5、)于12周后，取后肢跖肌肌肉，制備成冰凍切片，經(jīng)組織化學(xué)染色確認(rèn)成模。 (3)采用AnnexinV/PI雙重染色法檢測各組大鼠跖肌的細(xì)胞凋亡率；采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)；采用RT-PCR的方法檢測各組大鼠跖肌中Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)：分光光度計法檢測各組跖肌丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)活性的變化。

6、 體外實驗： (1)選健康SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠進(jìn)行骨骼肌原代細(xì)胞培養(yǎng)，并使用Desmin抗體采用免疫組化方法進(jìn)行骨骼肌細(xì)胞鑒定。 (2)以骨骼肌細(xì)胞作為研究對象，采用臺盼藍(lán)(Trypan blue)染色法檢測乙醇對骨骼肌細(xì)胞增殖的影響：Annexin V/PI雙重染色法及Hoechst33258熒光染色檢測對細(xì)胞凋亡的影響。(3)在乙醇作用的基礎(chǔ)上，采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測EGb761

7、對骨骼肌細(xì)胞增殖的影響，Annexin V/PI雙重染色法檢測EGb761對細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果： 體內(nèi)實驗： (1)實驗前后大鼠體重變化顯示酒精組大鼠的體重隨著酒精的攝入逐漸下降，到12周時明顯低于對照組；EGb761干預(yù)后大鼠體重較酒精組有所升高。 (2)肌肉形態(tài)學(xué)觀察顯示酒精組大鼠骨骼肌纖維出現(xiàn)了肌纖維變性、壞死，肌纖維萎縮呈角形、條形或不規(guī)則形改變，肌間結(jié)締組織增生等病理改變。而與酒精組相比，E

8、Gb761明顯改善大鼠肌肉病變程度。 (3)Annexin V/PI雙重染色法結(jié)果顯示酒精組的細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高，而EGb761干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率較酒精組明顯下降。 (4)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示酒精組與對照組相比Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)差異顯著，明顯增加，Bcl-2/Bax的比值下降；EGb761干預(yù)組與酒精組相比Bax蛋白表達(dá)顯著減少，Bel-2蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2/Bax的比值亦升高。 (5)

9、RT-PCR結(jié)果顯示酒精組Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)水平較對照組明顯增高；EGb761干預(yù)后，Bax表達(dá)較酒精組明顯下降，而Bcl-2明顯升高。 (6)生化指標(biāo)檢測結(jié)果：酒精組MDA含量較對照組明顯升高，SOD、GSH-Px活性明顯下降，iNOS活性明顯升高；EGb761干預(yù)后，MDA含量較酒精組明顯下降，而SOD、GSH-Px活性明顯升高，iNOS活性明顯降低。 體外實驗： (1)Desmin抗體免疫組化

10、結(jié)果顯示90％以上為骨骼肌細(xì)胞。 (2)臺盼藍(lán)(Trypan blue)染色法結(jié)果顯示細(xì)胞生存率隨著乙醇濃度的增加逐漸降低，而細(xì)胞死亡率隨著乙醇作用時間的增加而逐漸升高。 (3)Annexin V/PI雙重染色法及Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示，乙醇作用后骨骼肌細(xì)胞凋亡率呈時間及劑量相關(guān)性增加。 (4)MTT法結(jié)果顯示EGb761作用后，乙醇作用后的骨骼肌細(xì)胞生存率隨著EGb761濃度的增加而升高。An

11、nexin V/PI雙重染色法結(jié)果顯示EGb761可降低乙醇誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： (1)長期酒精攝入可造成骨骼肌細(xì)胞凋亡，推測與氧化．抗氧化失衡，iNOS增多及改變凋亡相關(guān)基因Bax和Bc1-2的表達(dá)有關(guān)。 (2)EGb761可降低CAM骨骼肌細(xì)胞凋亡率，推測與抑制氧自由基的生成，降低iNOS活性，下調(diào)促凋亡基因Bax，上調(diào)抑凋亡基因Bc1-2的表達(dá)有關(guān)。 (3)EGb761對慢性酒精中毒性肌病