非酒精性脂肪肝形成過程中肝臟蛋白質(zhì)譜變化的研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是多種因素引起肝臟疾病的一種病理學(xué)改變。近年來引起高度重視的并不限于這一疾病的病理學(xué)表現(xiàn)，而是能量過剩。能量物質(zhì)在肝內(nèi)積聚，不僅是代謝綜合癥在肝內(nèi)的特異表現(xiàn)，也是向非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatosis hepatitis，NASH)甚至肝硬化(liver cirrhosis)和肝癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。隨著代謝綜

2、合癥(metabolic syndrome)的發(fā)病率逐年增高，非酒精性脂肪肝引起了人們的空前重視。除了社會(huì)進(jìn)步，環(huán)境致病因素得以明確外，NAFLD發(fā)生的分子機(jī)制和發(fā)展規(guī)律仍不十分清楚。這給NAFLD的防治帶來了一定的困難。為此，本研究用高脂物質(zhì)飼以大鼠，形成以能量過?！吣芪镔|(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)積聚→發(fā)展為代謝綜合癥和NAFLD模型。用二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis)與質(zhì)譜(mass spect

3、rometry)聯(lián)合分析方法檢測(cè)NAFLD發(fā)展過程中不同階段的蛋白質(zhì)譜變化，試圖找到一至兩種功能蛋白質(zhì)分子，用以指導(dǎo)NAFLD發(fā)生機(jī)制的深入研究。
　　 方法：1.代謝綜合癥、NAFLD動(dòng)物模型的建立：20只SD大鼠隨機(jī)分組后分別予以普通和高脂飼料喂養(yǎng)，觀察不同時(shí)間的體重、OGTT值、LEE指數(shù)、肝指數(shù)、體脂及血脂變化趨勢(shì)，并觀察不同時(shí)間肝臟的病理特征及電鏡下亞細(xì)胞水平損傷特點(diǎn)。2.肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)分析：在上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，勻漿

4、抽提不同實(shí)驗(yàn)階段大鼠肝臟總蛋白進(jìn)行雙向凝膠電泳，從蛋白質(zhì)表達(dá)豐度角度尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì)；對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行胰酶酶解后用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)做肽指紋圖，結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，并分析各差異蛋白質(zhì)在非酒精性脂肪肝形成過程中的作用。
　　 結(jié)果：1.高脂飼料喂養(yǎng)組的SD大鼠的體重較普通組明顯增高(P<0.05)；高脂組的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCH)及肝指數(shù)均較普通組增高，

5、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；普通組大鼠糖耐量未見明顯異常，而高脂組則有明顯變化(P<0.05)。2.病理學(xué)改變：高脂組SD大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度及炎性活動(dòng)度較普通組明顯(P<0.05)；電鏡掃描顯示高脂組大鼠肝細(xì)胞亞細(xì)胞水平出現(xiàn)肝細(xì)胞膜絨毛萎縮、膽微管擴(kuò)張及線粒體腫脹等損害，而普通組大鼠類似病變則不明顯。3.在高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的不同階段中，肝內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)的變化具有一定的規(guī)律性：a.肝內(nèi)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)越來越少，飼養(yǎng)至18周時(shí)肝內(nèi)蛋白質(zhì)點(diǎn)

6、數(shù)減少20％以上。b.不同時(shí)間的蛋白質(zhì)變化以等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)變化最明顯，近中性的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)顯現(xiàn)減少的趨勢(shì)，而偏酸性的蛋白質(zhì)僅在18周時(shí)突然增多。c.有效地鑒定出4種酶蛋白質(zhì)，分別為甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶1(methionine adenosyltransferase I.alpha)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，mu2)、還原型輔酶Ⅰ脫氫酶(NADH dehydrogenase)和醛脫氫酶Al(

7、aldehydedehydrogenase family9，subfamily Al)。其中前三種蛋白質(zhì)表達(dá)量隨著高脂飲食的時(shí)間逐漸減少而醛脫氨酶則逐漸增多。
　　 結(jié)論：一、用高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠可模擬代謝綜合癥患者NAFLD的肝臟病理學(xué)改變。表現(xiàn)為：1.形態(tài)學(xué)：a.體重逐漸增加至肥胖，體內(nèi)脂肪及肝脂含量增加；b.肝細(xì)胞內(nèi)脂微粒形成；c.亞細(xì)胞水平損害的特點(diǎn)：呈現(xiàn)肝細(xì)胞膜絨毛萎縮→膽管細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)微管→細(xì)胞線粒體腫脹的損害發(fā)生

8、順序。2.生化學(xué)：表現(xiàn)糖耐量異常，血甘油三酯(TG)和總膽固醇(TCH)升高。二、肝內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)的變化具有一定的規(guī)律性，隨著喂以高脂飲食后出現(xiàn)如下變化：1.肝內(nèi)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)越來越少，飼養(yǎng)至18周時(shí)肝內(nèi)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)減少20％以上。2.不同時(shí)間的蛋白質(zhì)變化以等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)變化最明顯，近中性的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)顯現(xiàn)減少的趨勢(shì)，而偏酸性的蛋白質(zhì)僅在18周時(shí)突然增多。3.有效地鑒定出4種酶蛋白質(zhì)，分別為甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶1(methionine aden

9、osyltransferase I，alpha)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，mu2)、還原型輔酶Ⅰ脫氫酶(NADHdehydrogenase)和醛脫氫酶Al(aldehyde dehydrogenase family9，subfamily Al)。其中前三種蛋白質(zhì)表達(dá)量隨著高脂飲食的時(shí)間逐漸減少而醛脫氨酶則逐漸增多。這一規(guī)律意味著隨著肝內(nèi)脂肪的聚集，其抗氧化能力逐漸減弱，清除內(nèi)源醛基化產(chǎn)物的