異丙酚預(yù)先給藥對HepG2細胞缺氧復(fù)氧損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum)是真核細胞中由膜圍成的隧道系統(tǒng),是一種重要的細胞器,其基本生理功能包括蛋白質(zhì)的合成、修飾、加工、轉(zhuǎn)運以及Ca2+濃度的調(diào)節(jié)等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡高度敏感,肝細胞缺氧復(fù)氧時細胞內(nèi)ATP耗竭、大量氧自由基的產(chǎn)生和鈣離子平衡紊亂,可導(dǎo)致大量未折疊或錯誤折疊蛋白堆積于內(nèi)置網(wǎng),引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress,ERS)。
　　ERS是細胞一種

2、自我保護機制,細胞為適應(yīng)外界的不良刺激,維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),相繼活化一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,通過增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力,加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解,減少新生蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運。持續(xù)或者過強的ERS使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)不能重建,引起細胞自噬和凋亡造成細胞損傷。ERS途徑誘導(dǎo)細胞凋亡是不同于死亡受體途徑和線粒體途徑的第3種細胞凋亡途徑。ERS可通過C/EBP同源蛋白(CHOP)、C-JUN氨基末端激酶(JNKs)和Caspase-12途徑導(dǎo)致細胞的凋

3、亡。
　　異丙酚(Propofol)是一種非巴比妥類靜脈麻醉藥,因其起效快,蘇醒迅速而完全,持續(xù)輸注后不易蓄積,目前普遍用于麻醉誘導(dǎo)、鎮(zhèn)靜及麻醉維持。研究表明,肝臟缺血前給予異丙酚,可提高其對肝損傷的耐受能力,減輕肝臟缺血再灌注損傷。但其具體機制尚不清楚,可能與其抗氧化、清除氧自由基和上調(diào)血紅素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)的活力等有關(guān)。
　　目的:
　　本實驗評價異丙酚預(yù)先給藥對HEPG2細胞

4、缺氧復(fù)氧損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響,探討其減輕HEPG2細胞缺氧復(fù)氧損傷的機制,為指導(dǎo)臨床麻醉用藥提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、采用物理缺氧復(fù)氧的方法制備HEPG2細胞缺氧復(fù)氧損傷模型,模擬臨床的肝臟缺血再灌注損傷模型。采用隨機數(shù)字表法將HEPG2細胞隨機分為5組:正常對照組(control組)、缺氧6h復(fù)氧12h(H6/R12)組、缺氧12h復(fù)氧12h(H12/R12)組、缺氧24h復(fù)氧12h(H24/R12)組和缺氧48

5、h復(fù)氧12h(H48/R12)組。采用MTT比色法檢測HEPG2細胞的相對增值情況,OD值下降40％作為缺氧復(fù)氧模型制備成功的標準。
　　2、明確異丙酚減輕細胞缺氧復(fù)氧損傷的最適藥物濃度,采用隨機數(shù)字表法,將HEPG2細胞隨機分為6組:正常對照組(control組)、缺氧復(fù)氧組(H/R組)和缺氧復(fù)氧+異丙酚(5μmol)組(H/R+PPF5組)、缺氧復(fù)氧+異丙酚(10μmol)組(H/R+PPF10組)、缺氧復(fù)氧+異丙酚(20μm

6、ol)組(H/R+PPF20組)和缺氧復(fù)氧+異丙酚(40μmol)組(H/R+PPF40組)。采用MTT比色法檢測HEPG2細胞的相對增值率,10μmol異丙酚用于后續(xù)實驗研究。
　　3、采用隨機數(shù)字表法將HEPG2細胞隨機分為4組:正常對照組(control組)、異丙酚10μmol組(PPF組)、缺氧24 h復(fù)氧12h(H/R)組和缺氧24 h復(fù)氧12h+異丙酚10μmol組(H/R+PPF組)。采用Western blotin

7、g(WB)方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白:免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、真核細胞轉(zhuǎn)錄起始因子(eIF2α)、活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)和凋亡相關(guān)蛋白活化型Caspase-3的表達;采用RT-PCR的方法檢測BIP mRNA、CHOP mRNA、和Caspase-3mRNA的表達。
　　4、統(tǒng)計學處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標

8、準差(xs)表示,單因素方差分析用于不同組間比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.缺氧復(fù)氧對HEPG2細胞活力的影響
　　與control組比較,H24/R12組細胞增值率下降(P<0.05),由0.686±0.045下降至0.404±0.033,下降約40%。
　　2.不同濃度異丙酚對缺氧復(fù)氧(H/R)損傷HepG2細胞相對增值率的影響
　　MTT比色法結(jié)果顯示:與control組比

9、較,H/R組和H/R+PPF組細胞OD值下降,細胞相對增值率下降(P<0.05);與H/R組比較,H/R+PPF10組細胞OD值由0.303±0.030增加至0.505±0.079,細胞相對增值率增加最為顯著。
　　3.異丙酚(10μmol/L)對H/R損傷HepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白活化型Caspase-3表達的影響
　　與control組相比,H/R組和H/R+PPF10組細胞凋亡相關(guān)蛋白剪切型Caspase-3表達顯著上

10、調(diào)(*P<0.05);與 H/R組比較,H/R+PPF10組細胞凋亡相關(guān)蛋白剪切型Caspase-3的表達顯著下調(diào)(＃P<0.05)。
　　4.異丙酚(10μmol/L)對H/R損傷HepG2細胞Caspase-3 mRNA表達的影響
　　與control組相比,H/R組和H/R+PPF10組細胞Caspase-3 mRNA表達顯著上調(diào)(*P<0.05);與H/R組比較,H/R+PPF10組細胞Caspase-3 mRNA的

11、表達顯著下調(diào)(＃P<0.05)。
　　5.異丙酚(10μmol/L)對H/R損傷HepG2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP和CHOP表達的影響
　　與control組相比,H/R組和H/R+PPF10組細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP和CHOP的表達顯著上調(diào)(*P<0.05);與H/R組比較,H/R+PPF10組細胞的BIP和CHOP表達顯著下調(diào)(＃P<0.05)。
　　6.異丙酚(10μmol/L)對H/R損傷HepG2細胞

12、BIP mRNA和CHOP mRNA表達的影響
　　與control組相比,H/R組和H/R+PPF10組細胞BIP mRNA和CHOP mRNA的表達顯著上調(diào)(*P<0.05);與H/R組比較,H/R+PPF10組細胞BIP mRNA和CHOP mRNA的表達顯著下調(diào)(＃P<0.05)。
　　7.異丙酚(10μmol/L)對H/R損傷HepG2細胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4表達的影響
　　與control

13、組相比,H/R組和H/R+PPF10組細胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4的表達顯著上調(diào)(*P<0.05);與H/R組比較,H/R+PPF10組細胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4的表達顯著下調(diào)(＃P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.異丙酚預(yù)先給藥可通過抑制細胞凋亡減輕HEPG2細胞缺氧復(fù)氧損傷;
　　2.異丙酚預(yù)先給藥可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕細胞凋亡;
　　3.異丙酚抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的作用主要是