微囊蛋白-3在雌激素抑制去勢雌性大鼠心肌肥大中的作用.pdf

1、目前認為,左室肥厚是影響原發(fā)性高血壓(essential hypertension,EH)患者病殘率和死亡率的—個重要的獨立危險因子。因此,逆轉(zhuǎn)左室肥厚已成為當前治療EH的重要目標之一。左室肥厚的細胞病理學基礎(chǔ)不僅表現(xiàn)在心肌實質(zhì)細胞的肥大,還有心臟成纖維細胞(CFs)的過度增殖和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)大量沉積,導致心肌纖維化。左心室肥厚是心血管疾病的獨立危險因素,隨著左心室肥厚的發(fā)生、發(fā)展,猝死、

2、冠心病、心肌缺血、心力衰竭等心血管事件的發(fā)生率顯著增加。
　　 流行病學資料顯示,EH左室肥厚患者的發(fā)病率和死亡率與性別顯著相關(guān),女性絕經(jīng)前與同齡男性比較,EH的病夕匕率顯著低于男性,而卵巢切除或絕經(jīng)后的婦女心血管疾病發(fā)病率與死亡率明顯增高,與同齡男性比較無顯著性差異。表明EH左室肥厚的發(fā)生發(fā)展與雌激素有關(guān)。臨床資料證實,在標準降壓治療基礎(chǔ)上給予絕經(jīng)后EH女勝患者17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)可使左心室重量進

3、一步降低,提示E2可能具有逆轉(zhuǎn)左室肥厚的作用。
　　 現(xiàn)已證明,雌激素對心血管系統(tǒng)具有保護效應(yīng),可以通過調(diào)節(jié)血脂、調(diào)節(jié)血壓、對心臟的直接作用,以及觸發(fā)一些心臟保護因子的釋放等來抑制多種刺激因素所致的心肌肥大反應(yīng)。雌激素的效應(yīng)是由雌激素受體(estrogen receptor,ER)介導的,ER的存在是E2發(fā)揮效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。心血管系統(tǒng)存在著雌激素受體,雌激素在與ER結(jié)合后,可以通過基因效應(yīng)和非基因效應(yīng)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導,影響靶

4、基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)功能蛋白的合成,從而發(fā)揮多種生物學效應(yīng)。如改善血脂代謝,抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,抑制血管平滑肌細胞的增殖,促進血管內(nèi)皮損傷的修復等。而絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases,MAPKs)信號,G蛋白、酪氨酸激酶、P13K/Akt信號等信號途徑可能參與了雌激素的效應(yīng)。那么在雌激素對高血壓及其引起的心肌肥大有什么影響?是不是可以抑制高血壓引起的心肌肥大呢?且ERK2/1和Ak

5、t信號在其中有什么作用?目前還未完全明了
　　 近年來,許多研究表明細胞質(zhì)膜微囊(caveolae)在多條信號轉(zhuǎn)導途徑中起樞紐作用,其標志性結(jié)構(gòu)蛋白微囊蛋白(caveolin)可對許多關(guān)鍵信號分子的活性狀態(tài)起著直接的調(diào)節(jié)作用,在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。本實驗室以往的研究已經(jīng)證實了caveolin-1能夠抑制血管平滑朋細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的增殖,雌激素可以通過促進caveo

6、lin-1的表達發(fā)揮血管保護作用,抑制ERK1/2的活化,調(diào)節(jié)NOS的活性。那么caveolin是否參與了雌激素對心臟的保護效應(yīng),在其發(fā)揮什么作用呢?
　　 綜上所述,本課題從研究caveolin入手,探討了雌激素對壓力超負荷心肌肥大的影響,通過腹主動脈縮窄建立去勢雌性大鼠壓力超負荷動物模型,分別給予雌激素和安慰劑,通過子宮大小判斷模型建立是否成功；通過超聲心動圖檢測大鼠心臟功能及心肌肥大情況；取組織做石蠟切片,HE染色觀察心肌

7、肥大情況；免疫印跡方法探討整體情況下雌激素對壓力超負荷時信號蛋白表達的影響；培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細胞,用AngⅡ刺激其發(fā)生吧大反應(yīng),采用Bradford法、同位素法、免疫印跡等技術(shù),檢測雌激素對心肌細胞肥大的影響,觀察ERK1/2、P13K/Akt通路在其中的作用,探討caveolin-3是否是其關(guān)鍵分子,及雌激素對其的影響。從整體、細胞、分子水平分別研究17β-雌二醇對壓力超負荷導致的心臟肥大的影響,探討caveolin在雌激素心臟保

8、護效應(yīng)中作用,以加深對雌激素生物效應(yīng)及其作用的分子機制的認識,為臨床高血壓心臟病的防治提供新的思路。
　　 本論文主要包括以下三個部分:
　　 第1章:17β-雌二醇對去勢高血壓大鼠心肌肥大的影響
　　 第2章:ERK1/2和Akt信號在17β-雌二醇抑制AngⅡ誘導的大鼠心肌細胞肥大反應(yīng)中的作用
　　 第3章:微囊蛋白-3在17β-雌二醇抑制AngⅡ誘導的大鼠心肌細胞肥大反應(yīng)中的作用
　　 第1

9、章:17β-雌二醇對去勢高血壓大鼠心肌肥大的影響
　　 本章重點討論卵巢切除雌性SD大鼠,給予17β-雌二醇對腹主動脈縮窄引起的血壓升高、心功能改變和心肌肥大的影響。150g～200g雌性SD雌性大鼠140只,卵巢切除后隨機分成:假手術(shù)組(sham)和腹主動脈縮窄(abdominal aorta constriction,AAC)組。Sham組又隨機分為雌激素組(E2)和安慰劑組(placebo,P),AAC組也隨機分為雌激素組

10、(E2)和安慰劑組(placebo,P)。術(shù)后恢復1周,雌激素補充治療組(E2組)補充17β-雌二醇20μg/kg/d,安慰劑組(P組)給予溶劑對照,8周后做超聲心動圖檢測后處死,取子宮和心臟組織。
　　 1.1去勢及給予E2對大鼠子宮重量的影響
　　 術(shù)后8周,安慰劑組與雌激素替代組比較,AAC和sham組子宮分別縮小(83.61±3.5)％(OVX+AAC+P vs OVX+AAC+E2,P<0.05)和(83.06

11、±1.75)％(OVX+sham+P vsOVX+sham+E2,P<0.05)。
　　 1.2 HE常規(guī)染色
　　 HE染色見OVX+sham組心肌細胞呈梭形,核清藍色,肌纖維呈深紅色,胞漿淡紅色。腹主動脈縮窄使左室心室肌細胞橫徑(LVTDM)分別增加(24.08±6.52)％,(OVX+AAC+E2vs OVX+sham+E2組,P<0.05),(41.64±3.75)％(OVX+AAC+P vs OVX+sham+

12、P組,P<0.05)。腹主動脈縮窄術(shù)后,給予E2和給予安慰劑比較,左室心室肌細胞橫徑(LVTDM)減少(23.4±3.75)％(OVX+AAC+E2 vs OVX+AAC+P組,P<0.05)。而假手術(shù)組,給予雌激素組與安慰劑組比較左室心室嘰細胞橫徑(LVTDM)無明顯差異,(OVX+sham+E2vs OVX+sham+P組,P>0.05)。
　　 1.3心臟/體重比值和大鼠超聲心動圖
　　 與假手術(shù)組比較,AAC術(shù)后

13、心臟/體重比值顯著增加,P<0.05。而在AAC組,給與雌激素與給與安慰劑組比較,安慰劑組心臟/體重比值增加較給予雌激素組明顯,P<0.05。
　　 AAC組術(shù)后8周IVSd、LVSs較sham組,明顯增厚,P<0.05。FS、EF較術(shù)前明顯減低,P<0.05。而E2可抑制FS、EF的減少P<0.05。
　　 1.4免疫印跡檢測心臟組織ERK1/2的活性
　　 AAC可以大鼠心臟組織中的ERK1/2活性增加(AA

14、C VS sham P<0.05)。在AAC組給予E2可以抑制ERK1/2活性的增加,與安慰劑組比較,E2可以使ERK1/2活性降低(32.84±1.61)％(OVX+AAC+E2 vs OVX+AAC+P組,P<0.05)。而sham組磷酸化ERK1/2表達的變化無統(tǒng)計學意義。
　　 1.5免疫印跡檢測心臟組織Akt的活性
　　 AAC組大鼠心臟組織中的磷酸化Akt增加(AAC VS sham,P<0.05)。在AAC

15、組給予E2可以抑制磷酸化Akt的增加,與安慰劑組比較,給予E2可以使Akt瞵酸化降低(39.46±6.24)％(AAC+E2 vs AAC+P組,P<0.05)。而sham組磷酸化Akt表達的變化無統(tǒng)計學意義。
　　 1.6免疫印跡檢測心臟組織caveolin-3的表達
　　 Caveolin-3是心肌細胞caveolae的標志蛋白。與假手術(shù)組比較AAC可以使caveolin-3表達下降(AAC VS sham P<0.

16、05)。在AAC細給予E2能使之增加,與安慰劑組比較,給予E2可以使aveolin-3增加(26.11±7.3)％(AAC+E2 vs AAC+P組,P<0.05)。在sham組caveolin-3的變化無統(tǒng)計學意義。
　　 小結(jié):
　　 1.在去勢雌性SD大鼠腹主動脈縮窄模型中可以觀察到心肌肥大,ERK1/2和Akt活性的增加及caveolin-3表達減少。
　　 2.給予雌激素可以抑制心肌肥大,抑制ERK1/

17、2和Akt的活化及caveolin-3表達的減少。
　　 3.在去勢雌性SD大鼠腹主動脈縮窄模型給予雌激素可能是通過促進caveolin-3表達抑制ERK1/2和Akt活性的增加,進而抑制心肌肥大。
　　 第2章:ERK1/2和Akt信號在17β-雌二醇抑制AngⅡ誘導的大鼠心肌細胞肥大反應(yīng)中的作用
　　 本章主要在體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞探討了17β-雌二醇對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大反應(yīng)的影響。
　　

18、 2.1心肌細胞活性測定
　　 細胞活力=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)),本實驗中細胞活力在95％以上。
　　 2.2心肌細胞的形態(tài)和鑒定
　　 用胰酶消化分離的新生SD大鼠肌細胞在培養(yǎng)4～24h后,在倒置顯微鏡下可觀察到心肌細胞開始貼壁生長,初呈圓形,后為梭形,偶見單個細胞開始搏動,繼而細胞逐漸在瓶壁表面鋪展,形成不規(guī)則的星形,并伸出偽足,48h后形成細胞單層或細胞簇,呈放射狀排列的同心圓狀,其搏動同

19、步化,在含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,搏動頻率約為80～150次/min,不同細胞簇的搏動頻率可有不同,在培養(yǎng)過程中,隨著細胞間逐漸融合,亦可見整瓶心肌細胞的同步化搏動。用抗大鼠α-sacomericactin抗體,SABC免疫組化法進行鑒定,胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽性。鑒定結(jié)果顯示培養(yǎng)細胞陽性率達90％以上,表明細胞純度已經(jīng)達到實驗要求。
　　 2.3 E2對AngⅡ作用于心肌細胞48小時后心肌細胞蛋白質(zhì)含量的影響

20、>　　 10-7mol/L的AngⅡ作用48小時誘導蝴胞蛋白含量增加(54.81±6.45)％(vs control組,P<0.05),17β-雌二醇可以抑制AngⅡ誘導的心肌細胞蛋白質(zhì)含量的增加。10-12mol/L、10-10mol/L、10-8mol/L E2分別使AngⅡ誘導的心肌細胞蛋白質(zhì)含量的增加下降(12.03±4.21)％,(15.99±5.67)％,(21.47±7.1)％(vs AngⅡ組),單獨使用10-8mol

21、/L的17β-雌二醇對心肌細胞蛋白含量沒有顯著影響。
　　 10-8mol/L的17β-雌二醇分別作用4,12,24小時可使10-7mol/L的AngⅡ誘導的心肌細胞蛋白含量增加減少(11.74±5.43)％,(17.64±4.45)％,(25.68±7.44)％(vs AngⅡ組,P<0.05)。
　　 2.4 E2對AngⅡ作用心肌細胞48小時對心肌細胞表面積的影響
　　 10-7mol/L的AngⅡ誘導心肌

22、細胞表面積增加(48.98±2.23)％(vs control組,P<0.05),17β-雌二醇可以抑制AngⅡ誘導的心肌細胞表面積的增加。10-12mol/L、10-10mol/L、10-8mol/L E2分別使AngⅡ誘導的心肌細胞表面積的增加下降(9.42±1.88)％(14.98±4.89)％,(22.10±4.78)％(vs AngⅡ組),單獨使用10-8mol/L雌激素對心肌細胞表面積沒有顯著影響。
　　 10-8m

23、ol/L的17β-雌二醇分別作用4,12,24小時可以使10-7mol/L的AngⅡ誘導的心肌細胞表面積增加減少(12.66±1.88)％,(19.61±4.89)％,(24.63±4.78)％(vs AngⅡ組)。
　　 2.5 E2對AngⅡ作用于心肌細胞48小時后[3H]-亮氨酸摻入的影響
　　 10-7mol/L的AngⅡ誘導心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入增加(85.62±11.62)％(vs control組,P

24、<0.05),17β-雌二醇可以抑制AngⅡ誘導的心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入的增加。10-12mol/L、10-10mol/L、10-8mol/L E2分別使AngⅡ誘導的心肌細胞[3H]-亮酸摻入增加下降(10.73±3.38)％(14.64±6.7)％(20.63±9.76)％(vs AngⅡ組),單獨使用10-8mol/L的17β-雌二醇對心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入沒有顯著影響。
　　 10-8mol/L的17β-雌二

25、醇作用4,12,24小時可以分別使10-7mol/L的AngⅡ誘導的心朋細胞[3H]-亮氨酸摻入增加減少(9.34±9.03)％,(16.65±13.59)％,(24.59±8.66)％(vsAmgⅡ組)。
　　 2.6雌激素受體拮抗劑Tamoxifen(Ta)對E2抑制心肌肥大的影響
　　 與對照組相比,10-7mol/L AngⅡ可使心肌細胞蛋白合成增加(60.72±8.17)％(vs control組,P<0.05

26、)；該作用可被10-8mol/L E2預處理24h后明顯抑制,抑制率為(21.19±9.66)％(vs AngⅡ組,P<0.05)；預先給予10-6mol/L Ta作用30mins,可部分抑制E2降低AngⅡ誘導的心肌細胞蛋白合成增加的作用,抑制率為(24.24±7.26)％(vs E2+AngⅡ組,P<0.05)；AngⅡ組與AngⅡ+E2+Ta組之間無顯著性差異(P>0.05)；單獨給予Ta對心肌細胞蛋白合成沒有顯著影響(vs co

27、ntrol組,P>0.05)。
　　 與對照組相比,10-7mol/L AngⅡ可使心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入增加(67.18±10.06)％(vs control組,P<0.05)；該作用可被10-8mol/L E2預處理24h后明顯抑制,抑制率為(21.85±7.09)％(vs AngⅡ組,P<0.05)；預先給予10-6mol/L Ta作用30mins,可部分抑制E2降低AngⅡ誘導的心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入增加的作

28、用,抑制率為(25.01±11.89)％(vs E2+AngⅡ組,P<0.05)；AngⅡ組與AngⅡ+E2+Ta組之間無顯著性差異(P>0.05)；單獨給予Ta對心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入沒有顯著影響(vs control組,P>0.05)。
　　 2.7 ERK1/2信號轉(zhuǎn)導途徑在E2抑制心肌細胞肥大中的變化
　　 2.7.1 E2對心肌細胞肥大反應(yīng)中ERK1/2活性的影響
　　 與對照組比較,10-7mo

29、l/L AngⅡ能使蝴胞的磷酸化ERK1/2增加(177.12±14.6)％(vs control組,P<0.05),預先給予10-8mol/L E2使AngⅡ誘導的心肌細胞ERK1/2活性增加降低(vs AngⅡ組,P<0.05),ER拮抗劑Ta預處理30mins可逆轉(zhuǎn)E2對AngⅡ誘導的心肌細胞ERK1/2活性增加的抑制作用(vs E2組,P<0.05),單獨給予E2和Ta對ERK1/2磷酸化無顯著影響(vs control組,P>

30、0.05)。
　　 2.7.2 PD98059對E2抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大反應(yīng)的影響
　　 與對照組相比,10-7mol/L AngⅡ可使心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入增加(70.82±8.37)％(vscontrol組,P<0.05)；10-8mol/L E2預處理24h使AngⅡ誘導的心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入減少,其抑制率為(20.8±9.97)％(vs AngⅡ組,P<0.05)；PD98059(50μm

31、ol/L)預處理1h可以抑制E2使AngⅡ誘導的心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入減少的作用,其抑制率為(28.74±8.7)％(vs AngⅡ組,P<0.05)。
　　 2.73 E2對心肌細胞肥大反應(yīng)時MKP-1蛋白表達的影響
　　 10-7mol/L AngⅡ作用可增加心肌細胞MKP-1蛋白的表達增加(vs control組,P<0.05),事先用E2預處理,可以加強AngⅡ促進MKP-1蛋白表達增加的作用(vs Ang

32、Ⅱ組,P<0.05)。單獨給予E2對MKP-1表達無明顯影響(vs control組,P>0.05)。
　　 2.8 P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑在E2抑制心肌細胞肥大中的變化
　　 2.8.1 E2對心肌細胞肥大反應(yīng)中Akt活性的影響
　　 與對照組比較,10-7mol/L AngⅡ能使心肌細胞的磷酸化Akt增加(140.7±5.69)％(vscontrol組,P<0.05),給予10-8mol/L E2預處理

33、使AngⅡ誘導的心肌細胞磷酸化Akt增加降低了(41.82±4.13)％(vs AngⅡ組,P<0.05),ER拮抗劑Ta預處理30mins可逆轉(zhuǎn)E2抑制AngⅡ誘導的心肌細胞磷酸化Akt增加的作用(vs E2組,P<0.05),提示E2抑制AngⅡ誘導的Akt磷酸化噌加的作用至少部分是通過ER介導的。而單獨始予E2對Akt磷酸化無明顯影響(vs control組,P>0.05)。
　　 2.8.2 LY294002對E2抑制A

34、ngⅡ誘導的心肌細胞肥大反應(yīng)的影響
　　 與對照組相比,10-7mol/L AngⅡ可使心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入增加(73.93±11.31)％(vs control組,P<0.05)；10-8mol/L E2預處理24h使AngⅡ誘導的心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入減少(21.21±10.21)％(vs AngⅡ組,P<0.05)；LY294002使E2對AngⅡ誘導的心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入增加的抑制作用加強,抑制率為

35、(30.06±7.06)％(vs AngⅡ組,P<0.05),提示Akt的激活參與了AngⅡ誘導的心肌細胞肥大反應(yīng),而E2可通過抑制Akt的激活從而抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大反應(yīng)。
　　 小結(jié):
　　 1.在體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞,雌激素可以抑制AngⅡ誘導的蛋白合成增加、細胞表面積增大和[3H]-亮氨酸摻入增加。
　　 2.在體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞,雌激素可以抑制AngⅡ誘導的磷酸化ERK1/2增加

36、,促進MKP-1的表達。雌激素通過促進MKP-1表達抑制磷酸化ERK1/2增加進而抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大反應(yīng)。
　　 3.在體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞,雌激素可以抑制AngⅡ誘導的磷酸化Akt的增加。雌激素可以通過抑制磷酸化Akt的增加發(fā)揮效應(yīng)。
　　 第3章:微囊蛋白-3在17β-雌二醇抑制AngⅡ誘導的大鼠心肌細胞肥大反應(yīng)中的作用
　　 在原代培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細胞,用AngⅡ誘導發(fā)生肥大反應(yīng),觀

37、察caveolin-3在雌激素抑制心肌細胞肥大反應(yīng)中的作用。
　　 3.1 E2抑制心肌細胞肥大過程中caveolin-3表達的變化
　　 10-7mol/L AngⅡ可明顯降低caveolin-3蛋白的表達(Vs control組,P<0.05),提前用17β-雌二醇預處理細胞,可顯著增加AngⅡ作用后caveolin-3蛋白表達(vs AngⅡ組,P<0.05)。用了雌激素受體抑制劑Ta提前孵育細胞30mins,可以

38、抑制E2的作用,caveolin-3蛋白表達下降(vs E2+AngⅡ,P<0.05,),而單獨給予E2對caveolin-3的表達沒有影響。
　　 3.2 caveolin阻斷劑M-β-CD對E2抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大反應(yīng)的影響
　　 與對照組相比,10-7mol/L AngⅡ可使心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入增加(74.37±8.2)％(vscontrol組,P<0.05)；10-8mol/L E2預處理24h

39、使AngⅡ誘導的心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入減少(43.58±5.48)％(vs AngⅡ組,P<0.05)；M-β-CD(10-3mol/L)預處理心肌細胞2h,使E2對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大反應(yīng)的抑制作用減弱(vs E2+AngⅡ組,P<0.05)。
　　 3.3 caveolin阻斷劑M-β-CD對E2調(diào)節(jié)磷酸化ERK1/2效應(yīng)的影響
　　 為了探討caveolin-3在E2調(diào)節(jié)磷酸化ERK1/2蛋白表達過程中

40、的作用,我們使用了caveolin阻斷劑M-β-CD(10-3mol/L)預處理心肌細胞2h,可逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇抑制AngⅡ誘導的ERK1/2磷酸化的效應(yīng)。
　　 3.4 caveolin阻斷劑M-β-CD對E2調(diào)節(jié)磷酸化Akt效應(yīng)的影響
　　 為了探討caveolin-3在E2調(diào)節(jié)磷酸化Akt蛋白表達過程中的作用,我們使用了caveolin阻斷劑M-β-CD(10-3mol/L)預處理心肌細胞2h,可逆轉(zhuǎn)17β-雌二

41、醇抑制AngⅡ誘導的Akt磷酸化的效應(yīng)。
　　 小結(jié):雌激素可以通過促進caveolin-3的表達抑制AngⅡ誘導的ERK1/2和Akt活性增加,進而抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。
　　 結(jié)論:
　　 1.在去勢雌性SD大鼠腹主動脈縮窄模型中可以觀察到壓力超負荷引起的心肌肥大,ERK1/2和Akt活性的增加及caveolin-3表達減少。雌激素可以抑制壓力超負荷導致的心肌肥大,可能是通過促進caveolin-3