骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)PEDF的年齡相關(guān)性改變及基因干預(yù)對急性心肌梗死治療的影響.pdf

1、背景：心肌梗死（MI）嚴(yán)重威脅著人類的健康。近十余年，基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）療法為治療MI帶來了新的希望。MSCs可以起到改善病理性心室重塑，增強(qiáng)心臟功能，促進(jìn)疾病恢復(fù)的治療作用。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明MSCs的治療能力主要來源于旁分泌機(jī)制。MSCs可以在MI部位分泌大量的生物活性因子，調(diào)節(jié)MI后的病理過程。近期，色素上皮衍生因子（PEDF）被鑒定出是MSCs分泌的一種主要的多功能細(xì)胞因子。然而，MSCs分泌的PEDF在其對MI的治療過程中所

2、發(fā)揮的作用目前尚未報(bào)道。
　　在臨床試驗(yàn)中自體MSCs移植治療MI的確切效果尚不肯定。MI患者多為老年人，所以治療應(yīng)用的MSCs多來源于衰老的個(gè)體。目前對衰老是通過怎樣的機(jī)制影響MSCs對MI的療效仍不清楚。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)來源于衰老個(gè)體的MSCs的PEDF表達(dá)、分泌顯著增高。基于以上理論與新的發(fā)現(xiàn)我們提出如下假說：PEDF在MSCs對MI的病理調(diào)控過程中可能起著十分重要的作用，并且PEDF的年齡相關(guān)性表達(dá)對MSCs的治療效力有

3、非常重要的影響。
　　目的：探討MSCs分泌的PEDF在MI病理過程中的調(diào)控作用，以及來源于衰老個(gè)體的MSCs高表達(dá)PEDF對其治療效力的影響。試圖找到新的基因靶點(diǎn)對衰老的MSCs進(jìn)行干預(yù)從而改善MSCs的治療效果。
　　方法：（1）MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定：分別分離、培養(yǎng)來源于8w大C57BL/6小鼠（年輕）或18m大C57BL/6小鼠（衰老）的骨髓MSCs至第三代，對培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，并做成脂、成

4、骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)對MSCs進(jìn)行鑒定。（2）年輕MSCs與衰老MSCs的增殖與趨化能力的初步比較以及PEDF的表達(dá)、分泌差異檢測：MTT實(shí)驗(yàn)分析年輕MSCs與衰老MSCs在低氧或常氧條件下的增殖能力，使用Transwell系統(tǒng)測試兩種細(xì)胞受基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）趨化的移行能力，并通過流式細(xì)胞儀分析SDF-1的受體CXCR4的表達(dá)。行RT-PCR檢測年輕MSCs或衰老MSCs的PEDF的mRNA表達(dá)，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測年輕MSCs

5、或衰老MSCs條件培養(yǎng)基中PEDF含量。（3）腺病毒載體的構(gòu)建以及MSCs的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)：構(gòu)建表達(dá)人源性PEDF并含報(bào)告基因GFP的E1、E3缺陷人類5型腺病毒(adenovirus,Ad)載體，僅含GFP報(bào)告基因的空腺病毒載體（Ad.Null）作為對照；以及特異性對小鼠源性PEDF干涉的發(fā)夾狀RNA（shRNA）腺病毒載體（含GFP報(bào)告基因），含GFP報(bào)告基因的亂碼shRNA腺病毒載體作為對照（Ad.shctrl）。腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)

6、的MSCs（MOI值3000），倒置熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀測定感染效率，ELISA檢測體外人源性或小鼠源性PEDF表達(dá)情況。（4）小鼠MI模型的建立與細(xì)胞注入：建立8w大小鼠的MI模型，在手術(shù)后0.5-1h通過尾靜脈注入生理鹽水、年輕MSCs、衰老MSCs，年輕MSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad.Null（Y&Ad.Null）、年輕MSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad.PEDF（Y&Ad.PEDF）、衰老MSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad.shPEDF（O&Ad.shPEDF）或衰老MS

7、Cs轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad.shctrl（O&Ad.shctrl）各4.0×106。（5）檢測MSCs的趨化和PEDF在體內(nèi)的表達(dá)：將MI小鼠的心臟、肝臟、脾臟以及肺組織制作成8μm的冰凍切片，進(jìn)行HE染色或在熒光顯微鏡下觀察GFP陽性的MSCs在各臟器中的滯留情況。另外收集MI小鼠的骨髓細(xì)胞與外周血，常規(guī)裂解紅細(xì)胞后行流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性的MSCs所占比例。MI后心臟組織冰凍切片行人源性PEDF或小鼠源性PEDF的免疫熒光染色，觀察PEDF在M

8、I部位的表達(dá)情況。切下MI區(qū)域組織，勻漿后進(jìn)行人源性PEDF或小鼠源性PEDF的ELISA檢測，進(jìn)一步觀察PEDF在MI部位的表達(dá)情況。（6）分析MI部位的細(xì)胞表型：MI后對心臟組織冰凍切片行CD31、αSMA,vimentin,cardiactroponinI,或F4/80免疫熒光染色，觀察分別注入各組MSCs后MI部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化。（7）測量左室纖維瘢痕面積以及心臟功能：對

9、MI后心臟標(biāo)本行Masson染色，檢測注入各組MSCs后心臟纖維瘢痕面積。對小鼠行右側(cè)頸動(dòng)脈插管，檢測MI小鼠血流動(dòng)力學(xué)與心功能指標(biāo)。（8）MSCs與心臟成纖維細(xì)胞（CFs）共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：分離培養(yǎng)C57BL/6小鼠的CFs，分別將年輕MSCs、衰老MSCs、Y&Ad.Null、Y&Ad.PEDF、O&Ad.shPEDF或O&Ad.shctrl與CFs在Transwell系統(tǒng)中共培養(yǎng)、另外CFs與CFs共培養(yǎng)作為對照，檢測MSCs分泌的PE

10、DF對CFs的增殖、趨化作用。（9）PEDF對CFs的直接作用：觀察0-200ng/ml的PEDF對CFs的增殖、細(xì)胞周期、cyclinD1與P27的表達(dá)、凋亡以及趨化的作用。增殖分析使用MTT實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周期檢測通過流式細(xì)胞儀、cyclinD1與p27的表達(dá)使用westernblot，凋亡檢測通過流式細(xì)胞儀和Hoechst染色，趨化實(shí)驗(yàn)使用Transwell系統(tǒng)。（10）統(tǒng)計(jì)方法：所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤.多組比較首先使用單因素方差

11、分析，后續(xù)檢驗(yàn)使用LSD-t檢驗(yàn)。兩組比較使用Student-t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)使用SPSS11.5軟件。P值小于0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用雙側(cè)檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：（1）來源于衰老個(gè)體的MSCs的PEDF表達(dá)、分泌顯著增高：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明體外培養(yǎng)的第三代年輕MSCs或衰老MSCs均可以分化為成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞，并且高表達(dá)CD29,CD44,CD73,CD90和CD105,但低表達(dá)CD11b,CD34和CD45。年輕MSCs與衰老M

12、SCs在常氧或低氧下的增殖能力以及其向SDF-1誘導(dǎo)的移行能力沒有顯著差異，SDF-1的受體CXCR4在兩種細(xì)胞的表達(dá)也沒有明顯差異。但是RT-PCR與ELISA實(shí)驗(yàn)表明衰老的MSCs在低氧或常氧條件下PEDF的表達(dá)、分泌顯著增高。（2）構(gòu)建的腺病毒載體可以較高效的感染MSCs，并可得到理想的過表達(dá)或干涉效果：倒置熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，腺病毒載體對MSCs的感染效率均高于75％。年輕的MSCs感染Ad.PEDF后可在體外表達(dá)、

13、分泌人源性PEDF至少一周，分泌高峰為感染后第二天。衰老MSCs感染Ad.shPEDF后，其內(nèi)源性的小鼠PEDF表達(dá)被顯著抑制，抑制效應(yīng)可至少維持8d。所有對照組MSCs的PEDF表達(dá)沒有顯著變化。（3）經(jīng)外周靜脈注入的MSCs可較為特異的趨化至MI區(qū)域：我們發(fā)現(xiàn)MI后經(jīng)尾靜脈注入的GFP陽性MSCs少量存在于肺、肝、脾與外周血中，在骨髓細(xì)胞中的外源性GFP陽性MSCs有一過性的升高，但迅速回落。注入的MSCs主要位于MI區(qū)域與MI周圍

14、區(qū)域。（4）注入各組MSCs后MI區(qū)域內(nèi)的PEDF表達(dá)：免疫熒光與ELISA結(jié)果表明，與注入生理鹽水相比，注入年輕的MSCs與衰老的MSCs都可以使MI區(qū)域的PEDF含量下降。但是與注入年輕的MSCs相比，注入衰老的MSCs后MI區(qū)域的PEDF含量顯著增高。只有注入Y&Ad.PEDF后可以在MI部位檢測到人源性PEDF。另外，與注入O&Ad.shctrl相比，注入O&Ad.shPEDF后MI區(qū)域的PEDF含量顯著下降。（5）衰老MSCs

15、對MI的治療效力減低與其高表達(dá)PEDF密切相關(guān)：MI后心臟Masson染色以及心功能檢測結(jié)果表明，與注入生理鹽水相比，年輕的MSCs與衰老的MSCs均可以顯著的縮小梗死后纖維瘢痕面積，改善心臟功能。但是與年輕的MSCs相比，衰老的MSCs的治療效力顯著下降。當(dāng)年輕的MSCs過表達(dá)PEDF后，其對MI的治療效力顯著受損。當(dāng)衰老的MSCs的PEDF表達(dá)被干涉后，其對MI的治療效力顯著改善。（6）MSCs可通過分泌PEDF調(diào)節(jié)MI部位的細(xì)胞成

16、份：免疫熒光結(jié)果顯示，與注入生理鹽水相比，年輕的MSCs與衰老的MSCs都可以顯著的增加梗死部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的數(shù)目，減少成纖維細(xì)胞的數(shù)目。但是與注入年輕的MSCs相比，注入衰老的MSCs可致梗死部位含有更多的成纖維細(xì)胞，而較少的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞。此外，當(dāng)年輕的MSCs過表達(dá)PEDF后，可使MI部位的細(xì)胞表型類似于注入衰老的MSCs；而當(dāng)衰老的MSCs的PEDF表達(dá)被干涉后，可致MI部位

17、的細(xì)胞表型類似于注入年輕的MSCs。（7）MSCs通過分泌PEDF調(diào)控CFs的生物學(xué)行為：Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，年輕的MSCs與衰老的MSCs都可以抑制CFs的增殖。但是與年輕的MSCs相比，衰老的MSCs的抑制作用顯著下降。另外，當(dāng)年輕的MSCs過表達(dá)PEDF后其對CFs增殖的抑制作用下降；而當(dāng)衰老MSCs的PEDF表達(dá)被干涉后，其對CFs增殖的抑制作用得到改善。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEDF本身可促進(jìn)CFs在低氧條件下的增殖，并

18、呈現(xiàn)劑量依賴性。200ng/ml的PEDF可顯著的增加CFs在S期的細(xì)胞數(shù)量，并上調(diào)cyclinD1與下調(diào)P27的表達(dá)。而PEDF對CFs的凋亡沒有明顯作用。另外，衰老MSCs較年輕MSCs對CFs有更強(qiáng)的趨化作用，當(dāng)衰老MSCs的PEDF表達(dá)被干涉后這種趨化作用減弱，而年輕MSCs過表達(dá)PEDF后，其對CFs的趨化作用顯著增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEDF本身對CFs有較強(qiáng)的趨化作用。
　　結(jié)論：（1）與靜脈注入來源于

19、年輕個(gè)體的MSCs相比，靜脈注入來源于衰老個(gè)體的MSCs可使MI部位的細(xì)胞成份發(fā)生變化，對MI的療效顯著下降。（2）與來源于年輕個(gè)體的MSCs相比，來源于衰老個(gè)體的MSCs表達(dá)、分泌PEDF顯著增加。（3）MSCs可以通過分泌PEDF調(diào)控MI的病理過程。MSCs分泌的PEDF可作用于MI部位包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與心臟成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型，影響他們的生物學(xué)行為。（4）衰老MSCs的PEDF的高表達(dá)是造成其對M