一種番茄褐孢霉產(chǎn)生的高選擇性轉化人參皂甙Rb-,1-為Rd的β-葡萄糖苷酶.pdf

1、人參（Panax ginseng C．A Maye）為五加科人參屬植物，是我國的傳統(tǒng)名貴中藥。人參皂甙是人參的有效成分，到目前為止，已經(jīng)從人參中發(fā)現(xiàn)40多種人參皂甙。各種人參皂甙的含量不同，結構多樣，藥理活性也有很大的差別。研究發(fā)現(xiàn)某些在人參中含量很低的稀有人參皂甙具有很高的藥用價值和應用前景。但是，稀有人參皂甙含量太低，很難從人參中直接提取，依靠目前的化學合成技術也難以工業(yè)生產(chǎn)。制備這些稀有人參皂甙唯一可行的方法是改變某些高含量人參皂

2、甙的化學結構來完成?；瘜W轉化法通常選擇性較差，產(chǎn)率較低，同時容易造成環(huán)境污染。生物轉化則具備條件溫和、選擇性較好、副產(chǎn)物少、得率高、無污染和容易工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，被認為是制備稀有人參皂甙最具有潛力的方法。本論文通過篩選發(fā)現(xiàn)，番茄褐孢霉產(chǎn)生的高選擇性糖苷水解酶能將人參中含量最高的人參皂甙Rb1水解為唯一產(chǎn)物——稀有人參皂甙Rd。本文探索了這種β—葡萄糖苷酶的分離純化條件，研究了它的分子特征和性質，為工業(yè)應用奠定了基礎。 本論文的主

3、要結果如下： 1、從40種植物病原真菌中篩選出七種能夠不同程度地轉化人參皂甙的真菌，各種真菌的轉化底物和產(chǎn)物不同。其中番茄褐孢霉能夠特異性轉化人參皂甙Rb1成為Rd。最佳轉化條件為：加底物時間，24 h；底物濃度，0．25 mg/ml；培養(yǎng)液pH值，pH5-6；培養(yǎng)時間，8d；培養(yǎng)溫度，37℃。番茄褐孢霉產(chǎn)生轉化人參皂甙Rb1成為Rd的糖苷酶的最佳產(chǎn)酶條件為：V8汁培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)84小時。 2、培養(yǎng)84h的番茄褐孢霉V

4、8汁培養(yǎng)液經(jīng)過過濾離心、DEAE—cellulose陰離子交換柱層析、硫酸銨沉淀、Sepharose CL-6B凝膠過濾柱層析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱層析以及Mono Q陰離子交換柱層析等多步分離技術結合，成功分離純化出一種電泳純的β—葡萄糖苷酶G—I（人參皂甙Rb1轉化酶G—I）。G—I的純化工藝具有很高的穩(wěn)定性，能夠保證其穩(wěn)定制備。每50升番茄褐孢霉培養(yǎng)液約可獲得0．5 mg活性蛋白，回收率為9％，比活力

5、達17563 U/mg。 3、Superose610/300 GL凝膠過濾柱層析分析（HPLC）顯示G—I的洗脫曲線為對稱峰，分子量為80 KDa；經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）和等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF—PAGE）檢測，圖譜均顯示為一條蛋白帶，分子量為80 KDa，等電點（pI）為4．2，表明G—I已達至電泳純，且為一種單鏈蛋白質，相對分子量為80 KDa。經(jīng)胰蛋白酶水解、電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質譜

6、（Q—TOF2）分析，獲取了G—I中3個多肽鏈的氨基酸序列：1．LVAHEENVR，2．VGKDEGFAKAGGLSR，3．LPLEAGESGTATFNVR。利用BLAST工具在NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫和歐洲生物信息學研究所（EBI）統(tǒng)一蛋白知識庫中進行查詢和比對，沒有發(fā)現(xiàn)氨基酸完全相同的多肽段，表明此酶為一種新蛋白。將此肽段的氨基酸序列上傳到統(tǒng)一蛋白知識數(shù)據(jù)庫（UniProtKnowledgebase），得到了其授予的序列接受號P85

7、516。G—I的氨基酸序列與β—葡萄糖苷酶家族3的幾種真菌β—葡萄糖苷酶有高度的同源性，可能屬于此家族的成員之一。 4、酶反應動力學實驗證實，G—I具有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在pH4.0～11.0范圍內和40℃以下表現(xiàn)出良好的β—葡萄糖苷酶活性，最適反應pH值為pH6.0，最適反應溫度為45℃。Cu2+，2n2+在50mM時對酶活性有較強的抑制作用，相反，Na+、K+、Ca2+、Mrr2+和Mg2+對酶活性有輕微的刺激作用

8、。0.25 M的SDS沒有影響G—I的酶活性，0.25 mM的EDTA只是輕微抑制了G—I的活性。G—I的Km值為0.18 mM，最大反應初速度Vmax為5.52 mM/min。底物專一性分析發(fā)現(xiàn)，G—I能高特異性水解人工合成的底物pNPG，還能水解β—葡萄糖苷鍵連接的二糖如纖維二糖、龍膽二糖和槐二糖，再次表明此酶為一種β—葡萄糖苷酶。G—I對人參皂甙的底物專一性研究表明，此酶對人參皂甙Rb1表現(xiàn)了很強的水解活性，可達到pNPG的22.