人參銹腐菌中人參皂甙Rb-,1-水解酶的分離與性質(zhì)研究.pdf

1、人參是名貴的傳統(tǒng)中藥，含有多種藥物活性成分，人參皂甙是其中的主要活性成分之一。到目前為止，已經(jīng)從人參中分離并鑒定出四十余種人參皂甙，有些人參皂甙如Rg3、Rh2、C-K等具有重要的生物活性和藥理活性。由于這些人參皂甙含量低，但是活性好，所以制備這些人參皂甙成為近年來(lái)藥物學(xué)研究的熱點(diǎn)。這些稀有人參皂甙從人參中直接提取很難，有些稀有人參皂甙的化學(xué)結(jié)構(gòu)與人參中含量較高的人參皂甙如Rbl的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，只是少了若干個(gè)糖殘基，可以通過(guò)轉(zhuǎn)化高含量人

2、參皂甙中的糖基來(lái)獲得稀有人參皂甙。轉(zhuǎn)化人參皂甙糖基的方法通常有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法，其中生物轉(zhuǎn)化法具有選擇性高、副產(chǎn)物少、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，已成為制備稀有人參皂甙最具有潛力的方法。本論文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果為：
　　 1.優(yōu)化人參銹腐菌的培養(yǎng)及發(fā)酵條件
　　 通過(guò)培養(yǎng)基和接種量的選擇、測(cè)定最適發(fā)酵時(shí)間、人參皂甙誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、孢子再利用實(shí)驗(yàn)等優(yōu)化人參銹腐菌的培養(yǎng)及發(fā)酵條件，結(jié)果表明在V8汁液體培養(yǎng)基中以瓶/10板菌的接種量振蕩培

3、養(yǎng)84h時(shí)酶活性最高。人參皂甙誘導(dǎo)、孢子再利用兩種方法均沒(méi)有提高酶活性。
　　 2.分離水解人參皂甙Rbl的糖苷酶
　　 利用優(yōu)化的培養(yǎng)發(fā)酵條件培養(yǎng)人參銹腐菌，提取粗酶，探索分離方法。經(jīng)過(guò)分離方法的探索，摸索出一套比較理想的分離制備路線，最終采用如下的分離制備方法：培養(yǎng)84h的人參銹腐菌發(fā)酵液過(guò)濾、離心，將上清液（粗酶液）依次經(jīng)過(guò)DEAE-纖維素陰離子交換層析、30％-80％(NH4)2S04鹽析、Sepharose C

4、L-6B凝膠過(guò)濾層析、DEAE-Sepharose fast flow濃縮、Mono Q HR5/5陰離子交換層析(HPLC)步驟的分離后得到部分純化的酶，部分純化的酶與粗酶液相比，純化了313倍，產(chǎn)率為12％。
　　 3.確定人參皂甙Rbl水解酶的性質(zhì)
　　 部分純化后的酶的性質(zhì)研究表明：酶的最適pH為5.0，酶在pH3.0-11.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；酶的最適溫度為55℃，在20-55℃范圍內(nèi)酶的穩(wěn)定性較好。Mg2+

5、對(duì)酶活性有一定的激活作用：Na+、K+、Ca+、EDTA、Cu2+、Zn2+對(duì)酶活性均具有不同程度的抑制作用，其中Cu2+對(duì)酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。酶的底物專一性測(cè)定結(jié)果表明此酶能特異性水解β-D-葡萄糖苷鍵，說(shuō)明它是一種β-葡萄糖苷酶。該酶可轉(zhuǎn)化高含量人參皂甙Rbl，終產(chǎn)物為較高活性人參皂甙C-K，根據(jù)TLC結(jié)果推測(cè)轉(zhuǎn)化率約為70％。轉(zhuǎn)化路徑為：Rbl→Rd→F2→C-K。
　　 綜上所述，本論文優(yōu)化人參銹腐菌的培養(yǎng)及發(fā)酵條件