P-糖蛋白170與原發(fā)性腎病綜合征患兒糖皮質激素耐藥的臨床病理相關研究.pdf

1、腎病綜合征(Nephrotic Syndrome，NS)在小兒腎臟疾病中發(fā)病率僅次于急性腎炎，是小兒時期較為常見的一種腎臟疾病。1990年小兒腎臟病科研協(xié)作組調查結果顯示，兒童NS占同期泌尿系統(tǒng)疾病住院患兒的21％，而原發(fā)性腎病綜合征(Primary Nephrotic Syndrome，PNS)約占小兒時期NS的90％。迄今為止，糖皮質激素(glucocorticoid，GC)仍為最基本的治療藥物之一，NS患兒對GC治療的反應性是決定

2、其疾病轉歸極為重要的因素。臨床研究表明，近80％的NS患兒初發(fā)病時對GC敏感，另20％應用足量GC后仍對GC無反應，稱為GC耐藥或抵抗。另外，隨訪發(fā)現(xiàn)GC敏感NS患兒中，有50％-60％在治療過程中變?yōu)轭l復發(fā)，直至對GC依賴。GC抵抗型患兒病情容易復發(fā)或勤復發(fā)促進了腎臟病理損害的慢性進展，使最終發(fā)展為終末期腎病(endstage renal disease，ESRD)的幾率增加，故GC耐藥機制一直是研究的熱點問題。然而到目前為止，NS患

3、兒對GC治療抵抗的機制仍不甚明了。經(jīng)典的與GC耐藥有關的發(fā)現(xiàn)集中于GC受體(glucocorticoidreceptor,GR)分子結構和數(shù)量的改變、GR基因多態(tài)性、GR兩種亞型GRa、GRB的表達失平衡等方面，而GR的異常影響的是GC與GR結合及結合以后的效應階段，對GC與GR結合之前階段的研究知之甚少。近年來，學者們發(fā)現(xiàn)多藥耐藥基因(multidrug resistant 1，MDR1)基因產(chǎn)物P-蛋白170(P-glycoprot

4、einl70，P-gp170)參與介導了多種腫瘤、免疫性疾病等的GC耐藥。大多研究認為P-gp170是體內廣泛存在于細胞膜表面的一種藥物轉運泵，在藥物未與靶受體結合之前即與藥物結合，將藥物轉運出細胞外而造成耐藥；另外，P-gp170還可通過改變細胞內環(huán)境、下調GC受體、抑制細胞凋亡、影響細胞因子發(fā)揮作用等多種功能而介導多種疾病的GC耐藥。而目前國內外關于NS患兒P-gp170與GC耐藥關系的研究非常有限，依據(jù)少數(shù)學者的有關研究，NS患者

5、外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)P-gp170的表達與GC反應性有關；間接的實驗證明甾體類固醇激素為P-gp170的底物之一，GC耐藥NS患兒PBMC的P-gp170表達高于GC敏感者。但目前NS患者P-gp170介導GC耐藥的確切機制及在腎組織的表達情況尚未可知。由于GC的效應主要由Gc受體(GR)介導，GR在全身廣泛存在，而腎組織也是GC作用的主要靶器官，因而我們推測N

6、S患兒腎臟局部可能也存在P-gp170表達量的異常，而且這種異?？赡芘cGC耐藥有關。本研究首次通過檢測NS患兒PBMC細胞內地塞米松(Dexamethasone，Dex)濃度與P-gp170表達量并分析二者的關系，以證實NS患兒PBMc胞內P-gp170表達與GC反應性有關，在此基礎上，通過觀察P-gp170在NS患兒腎組織中的分布、表達變化及其與臨床GC療效的關系，P-gp170表達與病理及臨床指標的關系，進一步探討其在NS患兒GC耐

7、藥機制中的作用。 【目的】 分析GC敏感和耐藥NS患兒PBMC胞內Dex濃度變化與細胞膜表面P-gp170表達的相關性，并對有相關者做回歸分析，以證實P-gp170可作為GC的藥物轉運泵在NS患兒GC耐藥中發(fā)揮作用，并檢測比較GC敏感和GC耐藥NS患兒腎組織P-gp170mRNA及蛋白的表達，對兩者進行腎組織P-gp170表達的差異、定位、與NS復發(fā)、病理類型的關系等臨床及病理指標的分析，為探討NS患兒P-gp170介導

8、GC耐藥臨床的應用提供理論依據(jù)。 【方法】選用24名初發(fā)未應用激素治療的NS患兒為研究對象，根據(jù)隨訪資料顯示將其分成激素敏感(SSNS)與激素耐藥SRNS)組，10名健康體檢兒童作為正常對照。以外周血單個核細胞為研究的靶細胞，以Dex作用后，培養(yǎng)。分別在0h，12h，24h，36h收獲細胞，每個時間點均設空白對照，以反向高效液相色譜法(reverse highperformance liquid chromatography，R

9、-HPLC)檢測各組培養(yǎng)的不同時問點PBMCs細胞內Dex濃度變化；Wesrem blotting法檢測培養(yǎng)的不同時間點PBMC細胞P-gp170的表達；選取96名NS患兒，分為初發(fā)未用激素者23例，正規(guī)應用半年內無復發(fā)者26例及應用一年有反復復發(fā)者47例，10名因外傷切除的腎組織為正常對照，微穿刺技術取得腎皮質組織后，常規(guī)染色后確定病理類型及計算病理積分；同時以免疫組織化學法檢測腎組織P-gp170蛋白表達；原位雜交法檢測P-gp17

10、0mRNA的表達； 【結果】 1．NS患兒PBMC內Dex濃度隨培養(yǎng)時間的不同而不同，培養(yǎng)時間愈長，細胞內Dex濃度愈高； 2．GC敏感患兒PBMC加入Dex前后PBMC的P-gp170表達具有顯著性差異，加入Dex后細胞內Dex濃度漸增高，細胞膜P-gp170表達隨培養(yǎng)時間的延長而漸降低；GC耐藥患兒PBMC加入Dex前后細胞膜P-gp170表達無顯著性差異，P>0.05； 3．GC敏感NS患兒PBMC

11、細胞內Dex濃度變化與細胞膜表面P-gp170活性呈顯著負相關，回歸分析示GC敏感患兒細胞內Dex濃度隨P-gp170表達降低逐漸增高；而GC耐藥患兒細胞內Dex濃度與P-gp170活性無顯著相關； 4．免疫組織化學和原位雜交定位顯示GC敏感與耐藥NS患兒腎組織P-gp170均主要表達于腎小管，腎小球無表達；遠端小管表達顯著高于遠端小管，P<0.05,mRNA與蛋白的表達基本一致；GC敏感和GC耐藥NS患兒腎組織P-gp170的

12、表達具有顯著性差異，GC耐藥者P-gp170表達量顯著高于GC敏感者，P<0.05； 5. 腎臟病理積分與腎組織P-gp170的表達有顯著相關，病理積分較高者P-gp170表達陽性量高于病理積分低者，P<0.05：不同病理類型P-gp170的表達有差異，局灶節(jié)段硬化型腎病(FSGS)、膜性腎病(MN)和硬化性腎病(SGN)表達較高，微小病變(MCD)和系膜增生型(MsPGN)者表達較低，P<0.05； 6.<6歲組患兒和

13、>6歲組患兒P-gp170的表達無差異，P>0.05：復發(fā)者P-gp170的表達明顯高于無復發(fā)者，P<0.05：復發(fā)患兒腎組織P-gp170的表達與患兒的24小時尿蛋白定量(三次平均值)呈明顯正相關，與尿蛋白轉陰天數(shù)呈正相關，與首次復發(fā)與初發(fā)病的間隔的天數(shù)呈顯著負相關；P-gp170的表達與GC應用總量、總療程有呈顯著相關。 【結論】 1．健康兒童和NS患兒PBMC均有P-gp170的表達，NS狀態(tài)下可有P-gp170表

14、達增高，生理和病理狀態(tài)下P-gp170的表達發(fā)揮的作用不完全一致； 2．PBMC膜P-gp170表達增高與NS患兒GC耐藥有關，P-gp170表達增高介導了一部分NS患兒的GC耐藥； 3．Dex為P-gp170的作用底物之一，P-gp170參與了Dex類GC藥物PBMC膜胞內向胞外的轉運； 4．應用GC可誘導NS患兒膜P-gp170的表達增高，一部分GC耐藥者與GC應用所致P-gp170增高，導致GC耐藥；

15、 5．NS患兒PBMCP-gp170的表達增高為GC耐藥標志之一。 6．P-gp170在正常人。腎臟組織中即有一定量的表達，表達部位主要見于腎小管細胞膜； 7．P-gp170在NS患兒腎組織的表達與腎病病損有關，可結合病理類型和病理損傷程度同時檢測腎組織P-gp170來預測不同患兒GC反應性； 8．P-gp170的腎組織的表達與GC的用量有關，部分NS患兒耐藥機制由GC應用至一定量導致P-gp170的表達增高有