泛素與腎病綜合征nephrin，podocin，α-actinin-4的關(guān)系及MG-132的干預(yù)研究.pdf

1、目的：從分子水平探討腎病綜合征的發(fā)病機(jī)制，觀察阿霉素腎病大鼠血、尿生化改變及腎組織病理改變。檢測(cè)腎病模型中nephrin、podocin、α-actinin-4和泛素的表達(dá)和分布以及MG-132對(duì)腎病綜合征的干預(yù)作用。 方法：選取SD雄性大鼠40只，體重100-130g，隨機(jī)分成模型組和對(duì)照組（即假手術(shù)組）。模型組30只，進(jìn)行右腎切除一周后給予一次性尾靜脈注射阿霉素5mg/kg。對(duì)照組（A組）10只，尾靜脈注射等量的生理鹽水。從

2、腎切除之日起開(kāi)始計(jì)算，在第5周將模型組分為干預(yù)組和非干預(yù)組，其中干預(yù)組20只，腹腔注射MG-132，分為低濃度組（B組）和高濃度組（C組），連續(xù)注射3天；非干預(yù)組（D組）10只，腹腔注射與MG-132等量的生理鹽水，連續(xù)注射3天。所有大鼠均分籠飼養(yǎng)，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。 分別在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)：第6周和第8周留取血、尿標(biāo)本測(cè)定血白蛋白（ALB）、膽固醇（CHOL）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr），測(cè)定24h尿蛋白量。腎臟標(biāo)本部分放置

3、于10%福爾馬林液，部分分離腎皮質(zhì)，于-70℃保存。 HE染色觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化；用RT-PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)nephrin、podocin、α-actinin-4、泛素mRNA水平；western blot檢測(cè)nephrin、podocin、α-actinin-4、泛素蛋白的表達(dá)；間接免疫熒光觀察nephrin、podocin、α-actinin-4、泛素在腎組織的分布變化。 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分

4、析，結(jié)果以x±s表達(dá)，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。變量間關(guān)系采用直線相關(guān)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.尿蛋白改變 B組和C組分別與A組比較尿蛋白均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B、C兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第8周尿蛋白的程度較第6周有加重。 D組與A組比較，尿蛋白顯著

5、增多，第8周較第6周程度加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 2.血生化改變 第6周，與A組相比，B組的CHOL、BUN、Cr有明顯的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；C組的ALB比A組降低，CHOL、BUN、Cr升高，分別是A組的5.17倍、2.7倍、2.48倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；D組的ALB較A組明顯降低，是A組的0.43倍，CHOL、BUN、Cr升高，分別是A組的8.07倍、3.75倍、4

6、.20倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 第8周，與A組相比，B組的BUN、Cr升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；C組的ALB比A組降低，是A組的0.60倍，CHOL、BUN、Cr升高，分別是A組的5.09倍、6.10倍、3.62倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；D組的ALB較A組明顯降低，是A組的0.43倍，CHOL、BUN、Cr分別是A組的7.03倍、6.10倍、4.16倍，升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.

7、05）。 3.病理改變 A組第6周和第8周腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)基本正常。第6周B組和C組在部分腎小球充血腫大，腎小管上皮細(xì)胞疏松變、空泡變，腎小管灶性擴(kuò)張，可見(jiàn)蛋白管型。D組少數(shù)大鼠腎臟中有局灶性增生，間質(zhì)輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。第8周B組、C組、D組大鼠腎皮質(zhì)足突細(xì)胞明顯肥大，系膜基質(zhì)增生明顯，球囊壁增厚，彌漫性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，蛋白管型多見(jiàn)。部分D組大鼠腎小球節(jié)段硬化，球囊粘連，毛細(xì)血管袢瘤樣擴(kuò)張，間質(zhì)中度纖維化。 4

8、.RT-PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)nephrin、podocin、α-actinin-4、泛素mRNA水平nephrin mRNA：第6周，與A組比較，B組、C組、D組的nephrin mRNA水平下降至A組的0.84、0.80、0.66。第8周，與A組比較，B組、C組、D組的nephrin mRNA水平明顯下降，分別是A組的0.72、0.68、0.39，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 四組間比較，第8周各組nephrin mRNA水

9、平較第6周均有下降，B組、C組兩組間在第6周和第8周比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第8周D組的nephrin mRNA水平比第6周明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 podocin mRNA：第6周，與A組比較，B組、C組的podocin mRNA水平升高，分別上升了1.30倍，1.32倍，D組的podocin mRNA水平與A組相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；第8周，B組、C組的podocin

10、mRNA比A組水平稍升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；D組的podocin mRNA水平有明顯下降，是A組的0.57，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B組、C組、D組的podocin mRNA水平在第6周和第8周比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 α-actinin-4 mRNA：四組間比較，在第6周和第8周各組間α-actinin-4mRNA無(wú)明顯的上升或下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 泛素mRN

11、A：在第6周，與A組比較，B組、 C組、D組的泛素RNA水平均上升至A組的1.93倍，2.21倍，2.42倍；在第8周，與A組比較，C組、D組的泛素mRNA水平明顯上升，分別是A組的1.99倍，2.03倍，所有差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B組泛素mRNA與A組相比無(wú)明顯升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。四組間比較，第8周C組和D組的泛素mRNA水平比第6周明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 5.Weste

12、rn Blot檢測(cè)nephrin、podocin、α-actinin-4、泛素蛋白的表達(dá)Nephrin、podocin、α-actinin-4、泛素分子量分別為180 KDa、45 KDa、100 KDa、60 KDa；分別在100KDa、40KDa、100 KDa、40 KDa處出現(xiàn)清晰的條帶。 nephrin：與A組比較，B組、C組、D組的表達(dá)均有減弱，B組的nephrin表達(dá)在第6周和第8周分別是A組的0.74和0.62

13、倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C組的nephrin表達(dá)在第6周和第8周分別是A組的0.76和0.58倍，D組的表達(dá)在第6周和第8周分別為A組的0.28和0.37倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）； B組和C組在第6周和第8周比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。第8周C組的nephrin表達(dá)比第6周明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 podocin：與A組比較，B組、C組、D組的表達(dá)均有減弱，D組在第6周和第8周

14、分別為A組的0.53和0.44倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在第6周和第8周，B組和C組的表達(dá)與A組相比明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 α-actinin-4：B組、C組、D組蛋白表達(dá)量在第6周和第8周與A組相比，均無(wú)顯著差異（P>0.05）。 泛素：與A組比較，B組、C組、D組的表達(dá)均增強(qiáng)，D組在第6周和第8周分別為A組的1.70和2.36倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第6周B組和C組泛素

15、的表達(dá)與A組相比增強(qiáng)，分別是A組的1.19倍和1.22倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；第6周和第8周，B組和C組泛素表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）。 6.間接熒光免疫染色 經(jīng)染色發(fā)現(xiàn)nephrin、podocin、a-actinin-4免疫熒光染色表現(xiàn)為沿腎小球毛細(xì)血管袢連續(xù)樣分布，B組、C組、D組第6周nephrin和podocin從沿腎小球毛細(xì)血管袢線樣分布向不連續(xù)粗粒樣的分布模式轉(zhuǎn)變，第8周的表達(dá)進(jìn)一步減弱，

16、受累的腎小球進(jìn)行性增多。隨著病情的加重，a-actinin-4表達(dá)稍有減弱，但程度并不明顯。 泛素在腎小球和腎小管都有分布，呈細(xì)顆粒狀分布。隨著病情的加重，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，染色增強(qiáng)區(qū)逐漸擴(kuò)大，有的區(qū)域呈斑片狀和連續(xù)線狀增強(qiáng)，且第8周的染色比第6周稍有增強(qiáng)。 7.nephrin、podocin、α-actinin-4、泛素蛋白量與尿蛋白量之間的相關(guān)性分析 Nephrin蛋白表達(dá)量與尿蛋白量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.653

17、，P<0.05）； podocin蛋白表達(dá)量與尿蛋白量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.519，P<0.05）； a-actinin-4蛋白表達(dá)量與尿蛋白量無(wú)相關(guān)性（（r=-0.294，P>0.05）；泛素表達(dá)量與尿蛋白量呈正相關(guān)（r=-0.837，P<0.05）。 結(jié)論： 1.建立阿霉素腎病大鼠模型，觀察到nephrin、podocin、α-actinin-4、泛素在腎小球內(nèi)均有表達(dá)，泛素在腎小管-間質(zhì)中也有表達(dá)。泛素在病變發(fā)展中表