染色體9p21大片段缺失斷點(diǎn)精確定位探討及意義分析.pdf

1、研究目的：
　　腫瘤,是全球重要的公共衛(wèi)生問題。全球每年腫瘤年發(fā)病率約為202.8/100,000,年死亡率約為127.9/100,000。全美國(guó)每4個(gè)死亡中就有一個(gè)是由腫瘤所引起。中國(guó)惡性腫瘤呈逐年上升趨勢(shì),目前已成為第一位死因。早在20世紀(jì)初,科學(xué)家就已經(jīng)發(fā)現(xiàn),染色體結(jié)構(gòu)異常是腫瘤發(fā)病的關(guān)鍵因素。費(fèi)城染色體的研究表明:染色體結(jié)構(gòu)異常能引起基因表觀遺傳學(xué)改變,促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展?？截悢?shù)變異,包括擴(kuò)增、缺失等,是染色體結(jié)構(gòu)改變的重

2、要組成部分?；诨蛐酒目截悢?shù)變異檢測(cè),無法將拷貝數(shù)變異斷點(diǎn)定位至堿基水平。為研究拷貝數(shù)變異可能帶來表觀遺傳學(xué)改變,需要選擇適當(dāng)方法進(jìn)行斷點(diǎn)定位分析。本研究主要目的為:以染色體9p21大片段缺失為研究對(duì)象,以乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和胰腺癌細(xì)胞系 PANC-1為模板,探索缺失斷點(diǎn)定位的實(shí)驗(yàn)方法,分析拷貝數(shù)變異對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和胰腺癌細(xì)胞系PANC-1,提取DNA及RNA。利用

3、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(Multiplex Ligation-based Probe Amplification,MLPA),查明MCF-7和PANC-1細(xì)胞系中染色體9p21缺失情況,判斷缺失位點(diǎn)可能區(qū)間,并用常規(guī) PCR加以確認(rèn)。以MCF-7細(xì)胞系DNA為模板,探討長(zhǎng)片段PCR以及反向PCR進(jìn)行缺失斷點(diǎn)定位可行性,并明確MCF-7細(xì)胞系中9p21缺失斷點(diǎn)準(zhǔn)確位置。根據(jù)缺失斷點(diǎn)定位信息,分析可能的基因轉(zhuǎn)錄子改變,運(yùn)用cDNA快速擴(kuò)增技術(shù)

4、以及TA克隆測(cè)序,檢測(cè)可能形成的新融合轉(zhuǎn)錄子。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、MLPA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和胰腺癌細(xì)胞系PANC-1中,均存在累及MTAP、CDKN2A等基因大片段缺失的情況。MCF-7細(xì)胞系的端粒側(cè)斷點(diǎn)位于MTAP基因內(nèi),著絲粒側(cè)斷點(diǎn)位于CDKN2A基因內(nèi);PANC-1細(xì)胞系染色體9p21大片段缺失的端粒側(cè)缺失斷點(diǎn)位于MTAP基因內(nèi),著絲粒側(cè)的缺失斷點(diǎn)因超出MLPA檢測(cè)范圍而未可知。
　　2、長(zhǎng)片

5、段PCR以及反向PCR均證實(shí),MCF-7細(xì)胞系9p21缺失位點(diǎn)位于chr9:21819532至chr9:21989622之間,缺失片段大小約為170kb;斷點(diǎn)端粒側(cè)位于MTAP基因的外顯子4后,著絲粒側(cè)位于CDKN2A(p14)基因的內(nèi)含子1內(nèi)近外顯子1β處。
　　3、在MCF-7細(xì)胞系中,檢獲到一個(gè)新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子,由MTAP基因前4個(gè)外顯子與非編碼區(qū)chr9:22087143-22087648融合形成,含967個(gè)堿基、翻譯

6、125個(gè)氨基酸序列。在PANC-1細(xì)胞系中,檢獲到兩個(gè)新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子,其中一個(gè)與非編碼區(qū)chr9:22384168-22384481融合,含876個(gè)堿基、翻譯138個(gè)氨基酸序列;另外一個(gè)與非編碼區(qū)chr9:22674440-22674564融合,含598個(gè)堿基、翻譯149個(gè)氨基酸序列。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　MLPA技術(shù)是檢測(cè)染色體9p21大片段缺失的有效方法,能準(zhǔn)確判斷大片段缺失邊界范圍,適合于aCGH檢測(cè)后大樣本篩查

7、。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和胰腺癌細(xì)胞系PANC-1均存在著累及MTAP和CDKN2A基因大片段缺失。長(zhǎng)片段PCR、反向PCR是缺失斷點(diǎn)定位的良好方法,證實(shí)MCF-7細(xì)胞系中存在一個(gè)起于MTAP基因內(nèi)、止于CDKN2A基因內(nèi)、大小約為170kb的缺失片段。由于染色體9p21的缺失,乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中存在一個(gè)缺失、融合形成新MTAP轉(zhuǎn)錄子;胰腺癌細(xì)胞系PANC-1中,存在兩個(gè)缺失、融合形成新MTAP轉(zhuǎn)錄子。這些新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子是否

8、參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展,還有待進(jìn)一步研究。
　　目的:評(píng)價(jià)MLPA技術(shù)檢測(cè)染色體9p21大片段缺失的有效性及判斷缺失邊界的準(zhǔn)確性,探討染色體9p21大片段缺失的研究?jī)r(jià)值。
　　方法:利用MLPA技術(shù)檢查乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和胰腺癌細(xì)胞系PANC-1的9p21缺失情況,并利用PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)MLPA缺失邊界進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:MLPA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和胰腺癌細(xì)胞系均存在累及MTAP、CDKN2A等基因大片段缺失

9、的情況。MLPA檢測(cè)探明MCF-7細(xì)胞系的端粒側(cè)斷點(diǎn)位于MTAP基因內(nèi),著絲粒側(cè)斷點(diǎn)位于CDKN2A基因內(nèi);PANC-1細(xì)胞系染色體9p21大片段缺失的端粒側(cè)缺失斷點(diǎn)位于MTAP基因內(nèi),著絲粒側(cè)的缺失斷點(diǎn)因超出MLPA試劑盒的檢測(cè)范圍而未可知。PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)MLPA對(duì)MCF-7雙側(cè)的缺失邊界及PANC-1端粒側(cè)的缺失邊界判斷準(zhǔn)確。
　　結(jié)論:MLPA技術(shù)是檢測(cè)染色體9p21大片段缺失的有效方法,能準(zhǔn)確判斷大片段缺失邊界范圍,適合于

10、aCGH檢測(cè)后大樣本篩查。MCF-7細(xì)胞系內(nèi)存在著起于MTAP基因止于CDKN2A基因內(nèi)的純合子缺失;PANC-1細(xì)胞系中存在起于MTAP基因的純合子缺失。染色體9p21大片段缺失可能改變MTAP基因結(jié)構(gòu),有待進(jìn)一步研究。
　　目的:對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞系9p21缺失斷點(diǎn)進(jìn)行精確定位。
　　方法:多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞系9p21缺失斷點(diǎn)的大致區(qū)間;長(zhǎng)片段PCR和反向PCR擴(kuò)增缺失斷點(diǎn);引物步移縮

11、小缺失斷點(diǎn)的所在區(qū)間;測(cè)序確定缺失斷點(diǎn)的位置。
　　結(jié)果:MLPA檢測(cè)探明MCF-7細(xì)胞系的端粒側(cè)斷點(diǎn)位于MTAP基因內(nèi),著絲粒側(cè)斷點(diǎn)位于CDKN2A基因內(nèi);通過長(zhǎng)片段PCR/反向PCR、引物步移及測(cè)序確定:MCF-7細(xì)胞系中,缺失位點(diǎn)位于chr9:21819532至chr9:21989622之間,大小為170kb;斷點(diǎn)端粒側(cè)位于MTAP基因的內(nèi)含子4內(nèi),著絲粒側(cè)位于CDKN2A(p14)基因的內(nèi)含子1內(nèi)近外顯子1β處。
　

12、　結(jié)論:長(zhǎng)片段PCR、反向 PCR是缺失斷點(diǎn)定位的良好方法。在MCF-7細(xì)胞系中,存在一個(gè)起于MTAP基因內(nèi)、止于CDKN2A基因內(nèi)、大小約為170kb的缺失片段,其意義有待進(jìn)一步研究。
　　目的:在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和胰腺癌細(xì)胞系PANC-1中,檢獲可能由于9p21缺失形成的新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子。
　　方法:利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增cDNA末端,并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆后進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。
　　結(jié)果:在MCF

13、-7細(xì)胞系中,檢獲到一個(gè)新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子,由MTAP基因前4個(gè)外顯子與非編碼區(qū)chr9:22087143-22087648融合形成,含967個(gè)堿基、翻譯125個(gè)氨基酸序列。在PANC-1細(xì)胞系中,檢獲到兩個(gè)新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子,其中一個(gè)與非編碼區(qū)chr9:22384168-22384481融合,含876個(gè)堿基、翻譯138個(gè)氨基酸序列,另外一個(gè)與非編碼區(qū)chr9:22674440-22674564融合,含598個(gè)堿基、翻譯149個(gè)氨基