染色體9p21大片段缺失斷點精確定位探討及意義分析.pdf

1、研究目的：
　　腫瘤,是全球重要的公共衛(wèi)生問題。全球每年腫瘤年發(fā)病率約為202.8/100,000,年死亡率約為127.9/100,000。全美國每4個死亡中就有一個是由腫瘤所引起。中國惡性腫瘤呈逐年上升趨勢,目前已成為第一位死因。早在20世紀(jì)初,科學(xué)家就已經(jīng)發(fā)現(xiàn),染色體結(jié)構(gòu)異常是腫瘤發(fā)病的關(guān)鍵因素。費城染色體的研究表明:染色體結(jié)構(gòu)異常能引起基因表觀遺傳學(xué)改變,促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展?？截悢?shù)變異,包括擴增、缺失等,是染色體結(jié)構(gòu)改變的重

2、要組成部分?；诨蛐酒目截悢?shù)變異檢測,無法將拷貝數(shù)變異斷點定位至堿基水平。為研究拷貝數(shù)變異可能帶來表觀遺傳學(xué)改變,需要選擇適當(dāng)方法進行斷點定位分析。本研究主要目的為:以染色體9p21大片段缺失為研究對象,以乳腺癌細胞系MCF-7和胰腺癌細胞系 PANC-1為模板,探索缺失斷點定位的實驗方法,分析拷貝數(shù)變異對基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　實驗方法：
　　培養(yǎng)乳腺癌細胞系MCF-7和胰腺癌細胞系PANC-1,提取DNA及RNA。利用

3、多重連接探針擴增技術(shù)(Multiplex Ligation-based Probe Amplification,MLPA),查明MCF-7和PANC-1細胞系中染色體9p21缺失情況,判斷缺失位點可能區(qū)間,并用常規(guī) PCR加以確認(rèn)。以MCF-7細胞系DNA為模板,探討長片段PCR以及反向PCR進行缺失斷點定位可行性,并明確MCF-7細胞系中9p21缺失斷點準(zhǔn)確位置。根據(jù)缺失斷點定位信息,分析可能的基因轉(zhuǎn)錄子改變,運用cDNA快速擴增技術(shù)

4、以及TA克隆測序,檢測可能形成的新融合轉(zhuǎn)錄子。
　　實驗結(jié)果：
　　1、MLPA檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞系MCF-7和胰腺癌細胞系PANC-1中,均存在累及MTAP、CDKN2A等基因大片段缺失的情況。MCF-7細胞系的端粒側(cè)斷點位于MTAP基因內(nèi),著絲粒側(cè)斷點位于CDKN2A基因內(nèi);PANC-1細胞系染色體9p21大片段缺失的端粒側(cè)缺失斷點位于MTAP基因內(nèi),著絲粒側(cè)的缺失斷點因超出MLPA檢測范圍而未可知。
　　2、長片

5、段PCR以及反向PCR均證實,MCF-7細胞系9p21缺失位點位于chr9:21819532至chr9:21989622之間,缺失片段大小約為170kb;斷點端粒側(cè)位于MTAP基因的外顯子4后,著絲粒側(cè)位于CDKN2A(p14)基因的內(nèi)含子1內(nèi)近外顯子1β處。
　　3、在MCF-7細胞系中,檢獲到一個新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子,由MTAP基因前4個外顯子與非編碼區(qū)chr9:22087143-22087648融合形成,含967個堿基、翻譯

6、125個氨基酸序列。在PANC-1細胞系中,檢獲到兩個新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子,其中一個與非編碼區(qū)chr9:22384168-22384481融合,含876個堿基、翻譯138個氨基酸序列;另外一個與非編碼區(qū)chr9:22674440-22674564融合,含598個堿基、翻譯149個氨基酸序列。
　　實驗結(jié)論：
　　MLPA技術(shù)是檢測染色體9p21大片段缺失的有效方法,能準(zhǔn)確判斷大片段缺失邊界范圍,適合于aCGH檢測后大樣本篩查

7、。乳腺癌細胞系MCF-7和胰腺癌細胞系PANC-1均存在著累及MTAP和CDKN2A基因大片段缺失。長片段PCR、反向PCR是缺失斷點定位的良好方法,證實MCF-7細胞系中存在一個起于MTAP基因內(nèi)、止于CDKN2A基因內(nèi)、大小約為170kb的缺失片段。由于染色體9p21的缺失,乳腺癌細胞系MCF-7中存在一個缺失、融合形成新MTAP轉(zhuǎn)錄子;胰腺癌細胞系PANC-1中,存在兩個缺失、融合形成新MTAP轉(zhuǎn)錄子。這些新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子是否

8、參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展,還有待進一步研究。
　　目的:評價MLPA技術(shù)檢測染色體9p21大片段缺失的有效性及判斷缺失邊界的準(zhǔn)確性,探討染色體9p21大片段缺失的研究價值。
　　方法:利用MLPA技術(shù)檢查乳腺癌細胞系MCF-7和胰腺癌細胞系PANC-1的9p21缺失情況,并利用PCR實驗對MLPA缺失邊界進行驗證。
　　結(jié)果:MLPA檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞系MCF-7和胰腺癌細胞系均存在累及MTAP、CDKN2A等基因大片段缺失

9、的情況。MLPA檢測探明MCF-7細胞系的端粒側(cè)斷點位于MTAP基因內(nèi),著絲粒側(cè)斷點位于CDKN2A基因內(nèi);PANC-1細胞系染色體9p21大片段缺失的端粒側(cè)缺失斷點位于MTAP基因內(nèi),著絲粒側(cè)的缺失斷點因超出MLPA試劑盒的檢測范圍而未可知。PCR實驗證實MLPA對MCF-7雙側(cè)的缺失邊界及PANC-1端粒側(cè)的缺失邊界判斷準(zhǔn)確。
　　結(jié)論:MLPA技術(shù)是檢測染色體9p21大片段缺失的有效方法,能準(zhǔn)確判斷大片段缺失邊界范圍,適合于

10、aCGH檢測后大樣本篩查。MCF-7細胞系內(nèi)存在著起于MTAP基因止于CDKN2A基因內(nèi)的純合子缺失;PANC-1細胞系中存在起于MTAP基因的純合子缺失。染色體9p21大片段缺失可能改變MTAP基因結(jié)構(gòu),有待進一步研究。
　　目的:對乳腺癌MCF-7細胞系9p21缺失斷點進行精確定位。
　　方法:多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA)檢測MCF-7細胞系9p21缺失斷點的大致區(qū)間;長片段PCR和反向PCR擴增缺失斷點;引物步移縮

11、小缺失斷點的所在區(qū)間;測序確定缺失斷點的位置。
　　結(jié)果:MLPA檢測探明MCF-7細胞系的端粒側(cè)斷點位于MTAP基因內(nèi),著絲粒側(cè)斷點位于CDKN2A基因內(nèi);通過長片段PCR/反向PCR、引物步移及測序確定:MCF-7細胞系中,缺失位點位于chr9:21819532至chr9:21989622之間,大小為170kb;斷點端粒側(cè)位于MTAP基因的內(nèi)含子4內(nèi),著絲粒側(cè)位于CDKN2A(p14)基因的內(nèi)含子1內(nèi)近外顯子1β處。
　

12、　結(jié)論:長片段PCR、反向 PCR是缺失斷點定位的良好方法。在MCF-7細胞系中,存在一個起于MTAP基因內(nèi)、止于CDKN2A基因內(nèi)、大小約為170kb的缺失片段,其意義有待進一步研究。
　　目的:在乳腺癌細胞系MCF-7和胰腺癌細胞系PANC-1中,檢獲可能由于9p21缺失形成的新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子。
　　方法:利用cDNA末端快速擴增技術(shù)擴增cDNA末端,并將擴增產(chǎn)物進行TA克隆后進行測序檢測。
　　結(jié)果:在MCF

13、-7細胞系中,檢獲到一個新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子,由MTAP基因前4個外顯子與非編碼區(qū)chr9:22087143-22087648融合形成,含967個堿基、翻譯125個氨基酸序列。在PANC-1細胞系中,檢獲到兩個新MTAP轉(zhuǎn)錄融合子,其中一個與非編碼區(qū)chr9:22384168-22384481融合,含876個堿基、翻譯138個氨基酸序列,另外一個與非編碼區(qū)chr9:22674440-22674564融合,含598個堿基、翻譯149個氨基