單克隆抗體A3D8對(duì)三種人卵巢癌CSC-LCs生物學(xué)行為的影響及機(jī)制的初步研究.pdf

1、卵巢癌是全世界范圍內(nèi)女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。早期臨床癥狀的不明顯和腫瘤特異性標(biāo)記物的缺乏，使卵巢癌的早期診斷愈發(fā)困難。由于卵巢癌具有腹腔侵襲和種植的特點(diǎn)，使得卵巢癌患者不能得到徹底的根治。卵巢癌的常規(guī)治療(包括腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和化療藥物治療)雖然能去除癌癥腫物，卻忽視了治療后那些能夠存活下來(lái)的對(duì)化療耐藥的卵巢癌腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)。CSC是存在于腫瘤組織中的具有自我更新和分化為異質(zhì)性腫瘤群

2、的一群細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。近來(lái)，關(guān)于卵巢癌CSC和腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(cancer stem cell-like cells，CSC-LCs)的成功分離和鑒定已有報(bào)道。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面的CD44分子在人類(lèi)卵巢癌CSC中的表達(dá)上調(diào)。大量有力證據(jù)表明，CD44分子與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。如果用抗CD44的單克隆抗體去封閉CSC表面的CD44分子，勢(shì)必會(huì)對(duì)卵巢癌CSC的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定程度的影響。這些研究

3、將為特異性錨定CSC的新型腫瘤靶向治療策略提供一些新思路。
　　為了給卵巢癌靶向治療策略及其它相關(guān)的臨床藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本研究旨在揭示A3D8(一種抗CD44的單克隆抗體)對(duì)三種人卵巢癌CSC-LCs的細(xì)胞增殖、凋亡、致瘤性等生物學(xué)行為的影響作用及其分子機(jī)制。在我們的前期實(shí)驗(yàn)中，利用“無(wú)血清特殊生長(zhǎng)培養(yǎng)基”(以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并添加多種因子)并采用“懸浮球培養(yǎng)法”分別從三種不同來(lái)源的樣本(人卵巢癌細(xì)胞系SKOV

4、-3；上皮性卵巢癌患者實(shí)體瘤組織；上皮性卵巢癌患者的腹水)中分選并鑒定出三種人卵巢癌CSC-LCs(S-CSC-LCs，T-CSC-LCs和A-CSC-LCs)。為全面探討A3D8對(duì)人卵巢癌CSC-LCs的影響和機(jī)制，分別進(jìn)行了以下體外和體內(nèi)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞增殖MTS實(shí)驗(yàn)，軟瓊脂培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)，AO/EB雙重?zé)晒馊旧?、普通Giemsa染色及放大性Giemsa染色的顯微鏡檢，Annexin V-FITC/PI雙染的細(xì)胞凋亡流式檢

5、測(cè)，Rhodamine123染色的細(xì)胞線粒體跨膜電位(△ψM)流式檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，免疫印跡檢測(cè)及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞表面分子CD44被A3D8封閉后，細(xì)胞增殖明顯減弱；細(xì)胞的克隆集落形成能力被降低；G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少的同時(shí)S期的比例增加；細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生S期阻滯；細(xì)胞凋亡被顯著增強(qiáng)，鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)微核和典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。A3D8抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性。A3D8與DDP(一種卵巢癌

6、鉑類(lèi)化療藥物)的聯(lián)合使用可提高DDP抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的毒性作用。我們還發(fā)現(xiàn)A3D8作用后的CSC-LCs中的p21和caspase-3分子在mRNA和蛋白水平的表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)CDK2、cyclinA和bc1-2分子的表達(dá)降低。由此推論，A3D8在封閉細(xì)胞表面分子CD44后，可上調(diào)人卵巢癌CSC-LCs的細(xì)胞周期調(diào)控分子p21，它負(fù)向調(diào)控CDK2活性，減少CDK2/cyclinA復(fù)合物的形成，通過(guò)這種信號(hào)調(diào)節(jié)使細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生S期阻滯，

7、從而明顯抑制細(xì)胞增殖；而A3D8誘導(dǎo)凋亡的作用則是通過(guò)改變細(xì)胞線粒體的△ψM和下調(diào)抑制凋亡蛋白bc1-2的表達(dá)等機(jī)制來(lái)完成的。結(jié)果還顯示，A3D8可明顯降低人卵巢癌CSC-LCs在NOD/SCID小鼠體內(nèi)的致瘤性。
　　研究結(jié)果支持抗CD44單克隆抗體A3D8被應(yīng)用于新型的單克隆抗體腫瘤治療，在卵巢癌術(shù)后用單抗靶向卵巢癌CSC，抑制其增殖、誘導(dǎo)其凋亡，從而減少原位腫瘤復(fù)發(fā)和腹腔轉(zhuǎn)移；臨床化療用A3D8與DDP聯(lián)合使用可增強(qiáng)化療藥物