CD44單克隆抗體A3D8及其與阿糖胞苷聯(lián)合應用在急性髓細胞性白血病中抗腫瘤機制的研究.pdf

1、白血病是造血干細胞異常的惡性疾病，白血病細胞失去進一步分化成熟的能力而停滯在細胞發(fā)育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細胞大量增生積聚并浸潤其他器官和組織，同時使正常造血受抑制。根據(jù)白血病細胞的成熟程度和自然病程，白血病可分為急性和慢性兩大類，其中急性白血病又可分為急性髓細胞性白血病(或急性粒細胞性白血病，acute myeloid leukemia，AML)以及急性淋巴細胞性白血病。AML隨著年齡的增長其發(fā)病幾率也會隨之增高。盡

2、管AML發(fā)病率相對較低，但是每年僅美國就有約2.1％的癌癥病人死于該疾病。在我國，白血病的發(fā)病率為2.76/10萬，占癌癥病人發(fā)病率2.6％左右，其中AML的發(fā)病率占絕大多數(shù)，約為1.5％。
　　 最初人們認為黏附分子對于多細胞組織的形成以及聯(lián)系細胞與其細胞外機制(ECM)或臨近細胞等非常重要。CD44作為細胞表面的一種重要黏附分子，同時也是重要受體，其正常功能是介導淋巴細胞的歸巢、淋巴細胞向炎癥部位和黏膜相關(guān)淋巴組織歸位、黏附

3、細胞外基質(zhì)等。但由于其在白血病細胞以及多種惡性瘤細胞表面都有不同程度表達，同時參與腫瘤細胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤轉(zhuǎn)移等多種作用，并且變異型CD44(CD44v)的高表達與惡性瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，從20世紀末起，CD44已經(jīng)成為新型腫瘤療法的新靶點。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌的生成以及復發(fā)的過程中標準型CD44(CD44s)的表達量顯著增高。其它多種實體瘤如黑色素瘤、前列腺癌等也都高表達CD44。AML細胞表面同樣高表達CD44且不同AML

4、亞型細胞表面表達的CD44亞型也不盡相同。研究CD44的手段主要為單克隆抗體，已有研究發(fā)現(xiàn)，使用CD44單克隆抗體能夠誘導AML細胞分化或者凋亡，并且使用低濃度單克隆抗體能夠改變AML細胞周期，抑制細胞增殖，所以CD44單克隆抗體可以作為治療AML的一種手段。也有研究表明，使用小分子量HA或可溶性蛋白質(zhì)，同樣能夠阻斷某些由CD44傳導的細胞信號，從而抑制腫瘤的多藥耐藥性。并且，CD44不僅表達于各種腫瘤細胞表面，也高表達于腫瘤干細胞表面

5、，使用CD44單克隆抗體H90能明顯殺傷白血病干細胞。這些證據(jù)說明，CD44在AML以及其它腫瘤發(fā)生發(fā)展以及治療中十分重要。
　　 除骨髓移植外，細胞分化療法是近些年來最常用且有效治療AML的方法。通過維甲酸破壞PML-rarα(15q22的早幼粒白血病基因PML和17q21的維甲酸受體基因rarα)的治療方法能夠有效地治療AML M3病人。但是，由于其他亞型的AML中并不表達PML-rarα，極大地限制了這種方法在AML中的應

6、用。所以，找到治療其他AML亞型白血病的方法非常重要，殺傷AML細胞或者白血病干細胞是治療AML疾病的研究方向。由于AML細胞表面高表達CD44，故選擇性靶向CD44是治療AML的方法之一。CD44單克隆抗體A3D8具有多種治療AML的活性，包括抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡及分化等。但是，迄今為止，除細胞分化外，A3D8其它抗腫瘤活性機制尚無定論，使其應用始終停留在初始階段，所以研究A3D8的抗腫瘤機制并且將其應用于臨床，對于研究CD44

7、以及治療AML至關(guān)重要。
　　 而且，作為治療AML的首選化療藥物，阿糖胞苷(Ara-c)在臨床已經(jīng)廣泛應用于AML的治療，但是同時也對病人造成無法忍受的痛苦。通過A3D8靶向CD44提高阿糖胞苷靶向性以降低其用藥濃度以及縮短用藥時間，是解決這個問題的理想方法。
　　 本課題主要針對CD44單克隆抗體A3D8對AML細胞周期的影響和引起細胞凋亡作用的機制以及A3D8靶向何種CD44進行研究，并進一步研究A3D8提高阿糖胞

8、苷靶向性提高療效的機制，為AML的治療研究提供新思路。
　　 本課題的研究內(nèi)容如下。
　　 1 CD44單克隆抗體A3D8對細胞周期影響的研究試驗中通過使用不同濃度CD44單克隆抗體A3D8或透明質(zhì)酸(HA)處理AML細胞，用臺盼蘭對細胞進行染色后在顯微鏡下進行計數(shù)，得到細胞在處理后的增殖情況以及細胞毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A3D8對不同亞型AML細胞均有生長抑制作用，但是不同亞型抑制程度不一。但使用HA在同樣條件下處理并不

9、能引起AML細胞的生長抑制作用。
　　 采用PI(碘化丙啶)對AML細胞DNA染色后使用流式細胞儀測定細胞周期的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用A3D8處理后，AML細胞生長周期停留于DNA合成期，而HA不能改變AML細胞周期。
　　 本課題使用Western blot方法檢測處理后AML細胞中相關(guān)蛋白的表達水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種重要的細胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)Bid及P27在各種AML細胞株中表達量均有不同程度提高。然后通過電轉(zhuǎn)染敲除基因

10、的方法將相應小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)入AML細胞內(nèi)，破壞相應蛋白質(zhì)的功能。結(jié)果表明，A3D8產(chǎn)生的細胞生長抑制作用主要通過Bid及P27兩種蛋白質(zhì)進行調(diào)控，且由于Bid位于P27的上游，轉(zhuǎn)錄后基因沉默試驗(post-transcriptional gene silencingand aznsgene silencing，RNAi)同樣證明Bid沉默后同時能下調(diào)P27蛋白表達水平，反之則不能，故A3D8誘導的細胞生長抑制作用是由Bid

11、調(diào)控的。
　　 將細胞核與細胞質(zhì)分離是研究相應蛋白質(zhì)在細胞中如何轉(zhuǎn)移的方法之一。試驗主要是使用不同的細胞裂解液通過兩步不同強度對細胞進行裂解，然后分步分離。本試驗通過分離細胞核質(zhì)后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過A3D8處理后，Bid從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，說明Bid的轉(zhuǎn)位對細胞周期影響十分重要。
　　 2 CD44單克隆抗體A3D8引起細胞凋亡機制的研究(A3D8單獨以及與阿糖胞苷聯(lián)合用藥)試驗中使用Annexin V法以及檢測DNA片段法測定

12、AML細胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A3D8能夠在某些AML細胞如AML M2、M3中引起一定比例細胞凋亡(在NB4細胞以及SKNO-1中分別引起約30％、50％凋亡細胞)。
　　 采用Western blot方法檢測處理后AML細胞中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase-8被激活，這說明A3D8誘導產(chǎn)生的細胞凋亡作用主要通過死亡受體途徑調(diào)控，并且研究發(fā)現(xiàn)，CD44s表達量越高，細胞凋亡作用越明顯。試驗中使用caspase-8

13、抑制劑能夠抑制約50％由A3D8引起的細胞凋亡，但是caspase-9抑制劑則不能抑制A3D8的凋亡作用，進一步說明此凋亡作用主要通過死亡受體途徑調(diào)控而不是線粒體途徑。
　　 使用共聚焦顯微鏡考察了細胞內(nèi)外蛋白質(zhì)分布情況的變化，以及細胞膜上的脂質(zhì)筏與Fas在A3D8處理前后的相互作用。經(jīng)過A3D8處理過的AML細胞表面能夠使脂質(zhì)筏重新分布形成“帽狀”微域，并且使Fas同時轉(zhuǎn)位于脂質(zhì)筏，激活誘導細胞凋亡死亡受體途徑中的重要蛋白質(zhì)c

14、aspase-8；并且，采用膽固醇破壞劑甲基化-β-環(huán)糊精(MCD)37℃下孵育30 min破壞脂質(zhì)筏，使用共聚焦顯微鏡觀察或Western blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCD破壞脂質(zhì)筏后，能夠抑制A3D8誘導的AML細胞凋亡作用，并且抑制caspase-8的活化，故我們認為A3D8誘導細胞凋亡主要通過細胞表面脂質(zhì)筏的重新分布活化死亡受體途徑而不是通過線粒體途徑。
　　 本研究還發(fā)現(xiàn)，阿糖胞苷(Ara-c)能夠誘導CD4s蛋白表達量的

15、升高是通過Mnk、eIF4E的活化實現(xiàn)的，從而使本身沒有CD44s表達的HL-60細胞經(jīng)過Ara-c處理后CD44s表達量升高。采用共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，A3D8與Ara-c聯(lián)合用藥同樣在細胞表面使脂質(zhì)筏重新分布形成“帽狀”結(jié)構(gòu)，說明聯(lián)合用藥能夠有效擴大A3D8的應用范圍。即使某些AML細胞表面不表達CD44s，使用Ara-c后使CD44s表達量增加，達到擴大應用CD44療法的目的。然后通過電轉(zhuǎn)染敲除基因的方法將Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白

16、質(zhì)(Fas-Associated protein withDeath Domain，F(xiàn)ADD)siRNA轉(zhuǎn)入AML細胞內(nèi)，破壞死亡受體通路，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD缺失后能夠有效抑制caspase-8的活化，從而抑制AML細胞凋亡，說明脂質(zhì)筏激活的死亡受體途徑在此聯(lián)合用藥中十分重要。siRNA試驗以及共聚焦顯微鏡結(jié)果證明，埃茲蛋白(ezrin)與脂質(zhì)筏的重新分布密切相關(guān)。ezrin缺失后同樣能夠抑制A3D8誘導的細胞凋

17、亡作用。所以我們認為，此聯(lián)合用藥通過ezrin調(diào)控脂質(zhì)筏重新分布形成“帽狀”結(jié)構(gòu)，從而激活死亡受體途徑，使AML細胞凋亡。通過此聯(lián)合用藥，能夠顯著降低Ara-c的使用劑量，減少用藥時間，同時增加其靶向性，從而降低Ara-c在治療白血病時對病人造成的痛苦。
　　 本研究取得的成果和結(jié)論：
　　 細胞凋亡以及細胞生長抑制是臨床化療藥物治療惡性瘤的重要方法。盡管在AML病人中已經(jīng)廣泛使用化療藥物達到治療該疾病的目的，但是化療藥

18、物選擇性差、對病人造成痛苦以及病人對藥物的多藥耐藥等問題一直困擾著所有研究人員，并且由于無法選擇性殺傷白血病干細胞也是無法根治此疾病的原因之一。CD44雖然不是白血病干細胞表面上唯一受體，但是其與AML的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，所以選擇性靶向CD44或有希望成為治療AML的新方向。
　　 本論文取得的主要創(chuàng)新性成果與結(jié)論如下：
　　 (1)A3D8引起的細胞生長抑制作用是由bid進行調(diào)控，且需要bid從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細胞核中，從

19、而激活P27。
　　 (2)A3D8誘導的細胞凋亡作用是由脂質(zhì)筏的重新分布形成“帽狀”結(jié)構(gòu)，從而激活Fas誘導的死亡受體途徑引起。
　　 (3)A3D8誘導的細胞凋亡主要與CD44s表達量相關(guān)，表達量越高，細胞凋亡率越高。
　　 (4)Ara-c能夠活化Mnk、eIF4E，從而誘導CD44s蛋白表達量升高。
　　 (5)A3D8與Ara-c聯(lián)合用藥能夠提高A3D8的細胞凋亡作用，其機制與A3D8單獨用藥一