心室重構(gòu)和心肌凋亡對冠狀動脈微栓塞后心功能不全的影響及機制.pdf

1、第一部分小型豬冠狀動脈微栓塞后早期左室重構(gòu)的發(fā)生及其與TGF-β1/Smad3的相關(guān)性
　　研究背景：
　　冠狀動脈微栓塞(CME)是冠脈斑塊破裂或冠脈介入治療術(shù)后的一種嚴(yán)重且常見的并發(fā)癥。既往的動物研究已經(jīng)證實，冠脈微栓塞雖然不足以引起冠脈血流的明顯下降，甚至可能引起短暫性的血流升高(腺苷一過性釋放引起血管擴張)，但是CME可誘發(fā)局部心肌的炎癥反應(yīng)，使TNF-α、MCP-1等炎癥因子表達增強，出現(xiàn)心肌灌注和心功能不匹配、冠

2、脈血流儲備下降、冠脈阻抗增大及心功能的進行性下降。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)，作為一種重要的細(xì)胞因子，參與多種生理性和病理性反應(yīng)，如細(xì)胞生長、分化、纖維化發(fā)生、血管生成等。但TGF-β1是否參與冠脈微栓塞后的早期心功能下降及心室重構(gòu)尚不確定。
　　研究目的：
　　本實驗的目的是通過構(gòu)建豬冠狀動脈微栓塞模型，明確冠脈微栓塞后早期的心功能及心室重構(gòu)的發(fā)生，并通過分子生物學(xué)的技術(shù)，探究TGF-β1及其下游因子Smad3的表

3、達，分析血清TGF-β1與心室重構(gòu)、心功能的相關(guān)性。
　　研究方法：
　　18只雌雄不拘的小型豬(CME組15只；假手術(shù)組3只)，通過冠脈介入的方法，于前降支的中遠(yuǎn)段注入惰性微栓塞球12萬單位(直徑42μm)，從而建立冠脈微栓塞模型。通過高場強(3.0T)磁共振掃描儀評估微栓塞術(shù)前、術(shù)后6小時及術(shù)后1周心功能，分別測量LVEF、LNESV、LNEDV等指標(biāo)，同時檢測首過灌注和延遲掃描時心肌強化灶。術(shù)后1周處死并取出心臟，沿房

4、室溝水平切片，行心肌NBT染色，同時制備心肌石蠟切片用以免疫組織化學(xué)染色。
　　通過ELISA測量血清TGF-β1、IL-6和TNF-α；免疫比濁法測量Troponin T(cTnT)水平；應(yīng)用蛋白免疫印跡法(western blot)和免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織的TGF-β1和Smad表達；同時應(yīng)用Realtime-PCR的方法檢測心肌TGF-β1、Smad3的mRNA水平。此外，通過三色染色法檢測心肌組織內(nèi)的膠原水平。

5、　　研究結(jié)果：
　　應(yīng)用高場強(3.0T)MRI在不同時間點進行心臟檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組的結(jié)果相比，CME組冠脈微栓塞術(shù)后6小時的LVEDV(45.4ml vs.38.8ml，P<0.05)、LVESV(20.2ml vs.15.3ml，P<0.05)逐漸增大，術(shù)后6小時的LVEF則明顯下降(55.5％vs.60.6％，P<0.05)；術(shù)后1周時，微栓塞組LVEF值略有恢復(fù)，但與假手術(shù)組相比仍有顯著下降(56.4％vs.62.1％

6、.P<0.05)。
　　血清TGF-β1術(shù)后2小時即開始升高，術(shù)后6小時達峰值(相比于術(shù)后2小時，P<0.05)，術(shù)后1周時TGF-β1雖然略有下降，但仍明顯高于基礎(chǔ)值(P<0.01)。而血清TNF-α在術(shù)后2小時即明顯升高并達峰值，術(shù)后6小時則開始下降，術(shù)后1周時已降至基礎(chǔ)水平。另外一種炎癥因子IL-6，在術(shù)后2小時明顯升高，術(shù)后6小時達峰值，其在術(shù)后1周降至術(shù)前水平。心肌損傷標(biāo)志物cTnT在術(shù)后2小時開始升高，在術(shù)后6小時最明

7、顯(相比于術(shù)后2小時，P<0.05)。術(shù)后1周時，血清cTnT水平已下降，但仍高于基礎(chǔ)值。
　　通過相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)血清TGF-β1水平與INESV(r=0.409)、LVEDV(r=0.532)存在正相關(guān)，與LVEF(r=-0.438)存在負(fù)相關(guān)。作為心肌損傷標(biāo)志物之一的Troponin T也與LVEDV、LVESV、LVEF存在上述相似的相關(guān)性。而TNF-α與IL-6與上述心室內(nèi)徑、射血分?jǐn)?shù)未見明顯相關(guān)性。
　　Re

8、altime-PCR結(jié)果顯示術(shù)后1周的前壁心肌組織(微栓塞相關(guān)心肌)TGF-β1及Smad3 mRNA表達增強；Western blot和免疫組織化學(xué)檢測也證實上述兩者表達明顯高于后壁心肌(非微栓塞相關(guān)心肌)。同時應(yīng)用三色染色法染色心肌石蠟切片發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1周時，前壁心肌內(nèi)膠原表達明顯高于后壁心肌組織。
　　研究結(jié)論：
　　心肌左室重構(gòu)在冠脈微栓塞術(shù)后早期即已開始發(fā)生，同時心室重構(gòu)的發(fā)生可能與TGF-β1/Smad3的表達增強

9、有關(guān)。
　　第二部分 TNF-α介導(dǎo)的心肌凋亡對冠狀動脈微栓塞后心肌收縮功能不良的影響及機制
　　研究背景：
　　近來的實驗性研究證實，TNF-α在冠狀動脈微栓塞(CME)后心功能不全的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。另外，TNF-α參與介導(dǎo)的心肌凋亡作為心功能不全的一種病理機制亦受到廣泛重視。然而，在冠脈微栓塞后是否存在心肌的凋亡，尚不明確。同時，TNF-α所介導(dǎo)的心肌凋亡是否參與冠脈微栓塞后的心功能減退也未得到證實。

10、>　　研究目的：
　　本實驗的目的是證實冠狀動脈微栓塞后心肌的凋亡情況及微栓塞相關(guān)性局部心肌的收縮功能，同時應(yīng)用TNF-α抗體阿達木單抗治療冠脈微栓塞來探究TNF-α介導(dǎo)的心肌凋亡是否參與了冠脈微栓塞后心肌收縮功能的進行性下降。
　　研究方法
　　本實驗選用16只雌雄不拘的小型豬(體重20-25kg)，冠脈微栓塞的模型通過冠脈介入的方法，經(jīng)冠脈內(nèi)注射42μm的微栓塞球(總量12萬個)來制備。實驗共分三組：微栓塞組(8只

11、)，在CME術(shù)前20min經(jīng)冠脈內(nèi)注入10ml生理鹽水；治療組(5只)，在CME前20min經(jīng)冠脈內(nèi)注入阿達木單抗(2mg/kg)；假手術(shù)組(3只)，單純經(jīng)冠脈注入10ml生理鹽水，而不注入微栓塞球。
　　所有小型豬在CME術(shù)前、術(shù)后6小時、術(shù)后1周時進行心肌組織多普勒檢測，分析前壁心肌收縮峰值速度(S波)，評估微栓塞相關(guān)局部心肌的收縮功能。
　　應(yīng)用ELISA法檢測血清TNF-α水平；應(yīng)用western blot和免疫組織

12、化學(xué)法檢測微栓塞相關(guān)性前壁心肌組織的TNF-α蛋白表達水平。與此同時，以TUNNEL法檢測前壁心肌組織的凋亡細(xì)胞核；并應(yīng)用Realtime-PCR的方法檢測TNF-α、caspase3的mRNA表達。
　　研究結(jié)果：
　　通過組織多普勒技術(shù)評估冠脈微栓塞相關(guān)的前壁心肌收縮峰值速度(S波)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后6小時，在假手術(shù)組、單純微栓塞組、阿達木單抗治療組間的收縮峰值速度未見顯著性差異(1.51cm/s，1.45cm/s，1.44cm

13、/s，P>0.05)；術(shù)后1周時，單純微栓塞組的前壁收縮峰值速度明顯低于假手術(shù)組(1.20cm/s vs.1.50cm/s，P<0.01)，而阿達木單抗治療組，術(shù)后1周的前壁收縮峰值速度與單純微栓塞組相比，有明顯的改善(1.39cm/s vs.1.20cm/s，P<0.05)。
　　ELISA的血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，冠脈微栓塞組術(shù)后2小時，血清TNF-α即開始明顯升高(337.52±49.18 pg/ml vs.122.

14、50±32.32 pg/ml，P<0.05)，1周后降至正常水平(100.11±22.12 pg/ml vs.103.27±28.93 pg/ml，P>0.05)；而阿達木單抗治療組的血清TNF-α變化趨勢與單純微栓塞組基本相似(術(shù)后2小時：304.11±38.41 pg/ml vs.337.52±49.18 pg/ml，P>0.05：術(shù)后1周：102.19±20.32 pg/ml vs.100.11±22.12 pg/ml，P>0.0

15、5)。研究還發(fā)現(xiàn)，在單純微栓塞組，術(shù)后1周時前壁心肌組織內(nèi)不僅TNF-αmRNA和TNF-α蛋白的表達顯著高于假手術(shù)組，而且caspase3的mRNA表達和TUNNEL檢測發(fā)現(xiàn)的凋亡細(xì)胞核數(shù)均明顯高于假手術(shù)組(22.0±3.0/視野VS.3.0+2.0/視野，P<0.01)。而在阿達木單抗治療組(TNF-α抗體-2mg&g)，雖然治療組的前壁心肌內(nèi)TNF-αmRNA和TNF-α蛋白的表達未見明顯下降，但是前壁收縮峰值速度明顯高于單純微栓

16、塞組，(1.39cm/s vs.1.20cm/s，P<0.05)，同時凋亡細(xì)胞數(shù)也明顯下降(12.0±4.0 vs。22.0±3.0，P<0.01)。
　　研究結(jié)論：
　　TNF-α介導(dǎo)的心肌凋亡可能參與冠脈微栓塞后的局部心肌收縮功能減退；而在冠脈微栓塞術(shù)前經(jīng)冠脈注射TNF-α抗體可改善心肌收縮功能不全的進展。
　　第三部分擇期冠脈支架植入術(shù)后cTnT升高患者的危險因素分析及其與術(shù)后血清TNF-α水平的相關(guān)性
　

17、　研究背景：
　　擇期冠狀動脈支架植入術(shù)后cTnT水平的升高是預(yù)測近期和遠(yuǎn)期主要心血管事件的因素，其發(fā)生可能由支架內(nèi)血栓、分支血管閉塞、冠脈痙攣、無復(fù)流、冠脈微栓塞所致。目前對擇期冠脈支架術(shù)后cTnT升高的危險因素認(rèn)識尚不足。
　　研究目的：
　　本研究擬通過分析擇期冠狀動脈支架植入術(shù)后患者血清cTnT升高的危險因素，以及術(shù)后cTnT變化和TNF-α水平的相關(guān)性，從而為預(yù)防和早期識別冠脈微栓塞提供新的方法。
　　

18、研究方法
　　入選2010年5月至2010年10月在我院行擇期冠脈支架植入術(shù)的患者。將術(shù)后cTnT升高組(59例)和cTnT正常組(108例)進行比較，分析臨床因素(性別、年齡、高血壓病、高脂血癥、2型糖尿病、吸煙史、冠心病家族史)、實驗室檢測數(shù)據(jù)(血肌酐、血尿酸、血膽固醇、甘油三酯)、冠脈相關(guān)因素(冠脈病變血管數(shù)、本次手術(shù)植入支架數(shù)、冠脈嚴(yán)重度積分-Gensini積分)與術(shù)后cTnT升高的關(guān)聯(lián)。
　　分別應(yīng)用單因素分析(t

19、檢驗或卡方檢驗)、多因素分析(二元Logistic回歸)的方法，對支架植入術(shù)后cTnT的危險因素進行分析；應(yīng)用Spearman相關(guān)性檢驗，分析術(shù)后血清cTnT和TNF-α水平的關(guān)聯(lián)。
　　研究結(jié)果：
　　本研究共入組167位患者，其中男性123位(占73.7％)，女性44位(26.3％)。所有患者術(shù)前cTnT、CK、CK-MB均在正常范圍。在冠脈支架植入術(shù)后即刻，行多體位復(fù)查冠狀動脈造影，均未發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)血栓、分支血管閉塞、T

20、IMI血流受損、無復(fù)流發(fā)生、冠狀動脈痙攣、主支及分支血管夾層形成等現(xiàn)象。實驗分組：術(shù)后cTnT升高組(>0.03ng/ml)共59例，術(shù)后cTnT正常組共108例。
　　單因素分析發(fā)現(xiàn)，年齡、高血壓病、血總膽固醇、病變血管支數(shù)、本次手術(shù)植入支架數(shù)、Gensini積分是擇期冠脈支架植入術(shù)后cTnT升高的危險因素；經(jīng)二元Logistic多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)年齡、高血壓病、血總膽固醇、病變血管支數(shù)、本次手術(shù)植入支架數(shù)是術(shù)后cTnT升高的

21、獨立危險因素，其中高血壓病、病變血管支數(shù)、本次植入支架數(shù)、血膽固醇分別使得PCI術(shù)后cTnT升高的危險性增加172％、128％、87％、58％。
　　相關(guān)性分析還發(fā)現(xiàn)，冠脈支架植入術(shù)后血清cTnT與TNF-α水平的顯著正相關(guān)，r=0.493，P<0.01。
　　研究結(jié)論：
　　年齡、高血壓病、血總膽固醇、病變血管支數(shù)、本次手術(shù)植入支架數(shù)是術(shù)后cTnT升高的獨立危險因素，以上因素可能與冠脈微栓塞發(fā)生的相關(guān)。支架術(shù)后血清T