ARDS狀態(tài)下肺泡Ⅱ型上皮細胞鈉轉運功能的研究.pdf

1、研究背景與目的 傳統(tǒng)的理論認為：肺水腫的發(fā)病機制主要是由于液體靜水壓過高(心源性肺水腫)和肺泡毛細血管通透性增加(非心源性)所致。但是，自Goodman首次發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細胞存在鈉主動轉運方式后，接下來大量的研究均表明，肺水腫的形成除靜水壓力和上皮通透性的影響外，還受上皮細胞液體清除功能的影響，而這種清除功能是以鈉水的主動轉運形式來實現(xiàn)的。即肺水腫的機制中可能存在“二個增水、一個減水”的機制，這一種肺泡液體平衡調節(jié)減水機制的發(fā)現(xiàn)和

2、證實，將帶來肺水腫發(fā)生機理觀念的重大改變。我們前期的工作也證明存在肺水腫發(fā)生的“第三機制”，該機制的干預也可能將帶來治療上的重大突破。 肺泡上皮細胞覆蓋95％的肺泡面積，由扁平的Ⅰ型細胞和立方狀的Ⅱ型細胞組成。Ⅱ型細胞數(shù)量較Ⅰ型細胞多，除分泌表面活性物質外，還存在水通道(aquaporin，AQP)、鈉通道、Na+，K+-ATP酶，提示肺泡Ⅱ型上皮細胞在肺泡液體平衡調節(jié)中起著重要的作用，奠定了Ⅱ型細胞在鈉水轉運中的地位，所以對肺

3、泡Ⅱ型上皮細胞鈉通道功能的研究，有著十分重要的意義和價值。由于目前還不能分離和培養(yǎng)Ⅰ型細胞，且數(shù)量上也較少，無證據(jù)表明其參與鈉水的主動轉運。 鈉通道、Na+-K+-ATP酶是細胞膜主動轉運鈉離子的專用通道，隨著鈉離子的主動轉運而帶動水的轉移。那么，既然肺泡Ⅱ型上皮細胞存在鈉、水通道，存在主動液體轉運的“減水“機制，為什么還會發(fā)生肺水腫呢?如何來解釋這種現(xiàn)象呢?此外，肺泡上皮細胞鈉主動轉運功能的調節(jié)機制以及病理狀態(tài)如ARDS時上皮

4、細胞的液體吸收功能和調節(jié)機制目前也沒有定論。而鈉通道激動劑在減少或阻斷ARDS肺水腫的形成方面的作用，也需要進一步深入研究。 因此，我們通過大量的基礎工作，在預實驗獲得一定結果的基礎上，擬通過應用膜片鉗技術的全細胞電位固定模式，觀察急性分離后5h內的正常和油酸ARDS模型中大鼠肺泡Ⅱ型細胞全細胞鈉電流的大小及其對鈉轉運抑制劑、激動劑的反應，為ARDS發(fā)病機制的研究提供新的實驗方向和依據(jù)，從而進一步完善對ARDS肺水腫發(fā)生機理的認

5、識。 研究方法 實驗動物選用壯年健康雄性Sprague-Dawley大鼠(由南方醫(yī)科大學實驗動物所提供)，體重180-235g。本實驗分為2部分，第一部分主要是通過觀察急性分離后5小時內的肺泡Ⅱ型上皮細胞的全細胞鈉電流，以明確是否能用急性分離的細胞來研究細胞鈉主動轉運功能，為進一步實驗打下基礎；第二部分實驗分為油酸組和正常生理鹽水對照組，主要是觀察正常和ARDS狀態(tài)下肺泡Ⅱ型上皮細胞的鈉電流及其對鈉通道激動劑的反應，這部

6、分是本實驗的重點和關鍵.具體方法如下所述： 大鼠ATⅡ的分離、純化和鑒定：采用改良的胰酶消化法分離肺泡Ⅱ型上皮細胞后，用大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿純化，并用0.4％臺盼蘭溶液鑒定細胞活力，用改良的鞣酸染色法以及透射電鏡鑒定細胞純度，并在透射電鏡下觀察肺泡Ⅱ型上皮細胞的超微結構。 大鼠油酸ARDS模型的建立：油酸是一種具有較強毒性的飽和脂肪酸，進入機體后會對機體產生很復雜的影響，特別是對肺組織影響較大，可誘發(fā)并擴大氧化性肺損傷

7、。油酸模型是目前公認比較好的ARDS模型。本實驗采用經尾靜脈注射油酸法建立大鼠ARDS模型，油酸用量為0.1ml/kg。 膜片鉗實驗：本實驗采用膜片鉗技術中的全細胞電位固定記錄模式測定電流強度。細胞封接并形成全細胞狀態(tài)后，立即調節(jié)相關旋紐補償串連電阻、補正電容性電流使其盡可能地變小，濾波頻率為1kHz。在實驗的第一部分，應用階梯式脈沖來測定跨膜電流的膜電位依賴性，在-40mv的鉗制電位下，給予細胞膜的電刺激從-100mv起以20

8、mv的步幅遞增到+100mv，激活形成一系列跨膜電流；實驗的第二部分，鉗制電位仍舊為-40mv，每5秒給予細胞膜-100mv的電刺激，共記錄5次。獲得的所有電流信號通過Clampex和Fetchen采樣程序采入計算機，采樣頻率設為5kHz。采集到的數(shù)據(jù)用Clampfit6.0軟件和Fetchan進行分析.研究結果 1.我們改良后的大鼠ATⅡ細胞的分離純化方法是可行的。經臺盼蘭染色測定細胞活力正常組89.6±2.6％，油酸組85.

9、1±4.6％。經鞣酸特殊染色后鑒定ATⅡ細胞純度，正常組純化前細胞純度為74.9±3.8％，純化后明顯上升至88.4±3.3％，油酸組純化后純度82.7±3.7％。 2.急性分離的肺泡Ⅱ型上皮細胞具有鈉主動轉運功能。在全細胞的電位固定記錄模式下，我們成功地記錄到急性分離后5小時內的大鼠ATⅡ細胞的跨膜電流。當應用SES為浴液時，該電流的翻轉電位在0mv左右；而當浴液中含有10μM阿米洛利時，該細胞的跨膜電流明顯減小，且翻轉電位明

10、顯改變，約為-40mv。由此可見該跨膜電流是以阿米洛利敏感性鈉電流為主，其翻轉電位約為+50mv。 3.大鼠油酸ARDS模型的成功建立以及病理狀態(tài)下ATⅡ細胞的成功分離是實驗第二部分的前提和基礎。經大鼠尾靜脈注射油酸制備ARDS急性動物模型成功率高，注入油酸后30s大鼠即出現(xiàn)明顯的癥狀如呼吸急促、顏面四肢皮膚發(fā)紺等，血氣分析顯示PH、PaO2明顯下降，PaCO2明顯上升；雙肺明顯充血、出血以及大片水腫，肺組織HE染色觀察可見肺泡

11、和肺間質水腫、出血；毛細血管擴張、充血，粒細胞浸潤；肺泡腔大量血性液體滲出，部分可見局灶性肺不張。油酸ARDS大鼠ATⅡ細胞的分離難度明顯增加，分離后活力85.1±4.6％，純度82.7±3.7％,均明顯低于正常組。電鏡下見細胞變性、凋亡甚至崩解，板層體排空出現(xiàn)空泡樣改變，微絨毛消失。 4.給予細胞-100mv刺激時正常組全細胞鈉電流-101.11±11.41PA，而油酸組為-65.17±11.48PA，較對照組明顯下降(p＜0

12、.01)，但二者均能被阿米絡利顯著抑制；油酸組對特布他林的敏感性較對照組有所增高，應用特布他林后全細胞鈉電流可上升一倍以上，經統(tǒng)計學分析二者之間存在顯著差異(p＜0.01)。 結論 1.采用改良的胰酶消化法可以成功分離正常和油酸ARDS大鼠的ATⅡ細胞，用大鼠IgG包被培養(yǎng)皿純化細胞、鞣酸染色法鑒定細胞純度簡單可行，而透射電鏡是鑒定細胞的金標準。 2.急性分離的肺泡Ⅱ型上皮細胞具有鈉主動轉運功能，其全細胞鈉電流能

13、夠被阿米洛利明顯抑制，而特布他林則可使該電流明顯增大，提示鈉通道抑制劑和激動劑均能對其產生影響。觀察急性分離的ATⅡ細胞鈉電流是本實驗的創(chuàng)新點之一。 3.經尾靜脈注射油酸建立大鼠ARDS急性模型是一個相對簡單而成功率高的方法，大鼠血PaO2明顯下降，PaCO2明顯上升，肺部出現(xiàn)明顯病理改變，上皮細胞的超微結構也出現(xiàn)明顯變化。 4.ARDS狀態(tài)下，ATⅡ細胞受損明顯，但其仍舊具有一定的鈉轉運功能，且對鈉通道激動劑的敏感性較