miR-21-5p拮抗人肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的研究.pdf

1、目的：探討miR-21-5p是否具有抗人AT-Ⅱ凋亡作用，并驗證直接作用于miR-21-5p的靶基因。
　　方法：1、將人肺泡II型上皮細胞分為A組（空白對照組：直接培養(yǎng)）、B組（H2O2損傷組：加入0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)）、C組（miR-21-5p慢病毒過表達載體+0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)）、D組（慢病毒空白載體+0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)）。分別于0h、12h、24h、36h、48h進行CCK8細胞增殖

2、活力檢測，了解A、B、C、D四組細胞增殖活力情況。2、各組于培養(yǎng)24小時后進行流式細胞檢測，比較A、B、C、D四組細胞凋亡率。3、Western blot檢測和Real time PCR檢測：比較A、B、C、D四組間PDCD4 miRNA的表達變化，進一步明確miR-21-5p與PDCD4的相關(guān)性。4、雙熒光素酶報告基因檢測：空病毒細胞組與過表達miR-21-5p細胞組在轉(zhuǎn)染48h后，將構(gòu)建好的目的報告基因PDCD4自然序列（野生型）和

3、PDCD4突變序列（突變型）插入細胞啟動子片段（插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因），使用自動發(fā)光檢測儀讀取熒光強度，比較野生型與突變型的熒光強度，探討miR-21-5p是否直接作用于PDCD4，驗證miR-21-5p靶基因是否為PDCD4。
　　結(jié)果：1、CCK8細胞增殖活力從0h-48h之間，隨著時間的延長，A組的細胞增殖活力逐漸增強，B、C、D三組的細胞增殖活力逐漸下降（p＜0.05）,C組細胞增殖活力下降程度較B、D緩慢

4、（p＜0.05），說明miR-21-5p過表達后細胞具有抗凋亡作用。2、流式細胞檢測細胞凋亡率：與A組比較，B、C、D三組的細胞凋亡率有所增加，而C組的細胞凋亡率較B、D兩組低（P＜0.05）。3、Western blot檢測和Real time PCR檢測：A組PDCD4 miRNA表達量＜B、C、D三組（P＜0.05），C組PDCD4 miRNA表達量＜B、D兩組（P＜0.05），與B組與D組比較無統(tǒng)計學差異。4、雙熒光素酶報告基因

5、檢測：野生型過表達miR-21-5p細胞組（構(gòu)建自然序列PDCD4片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因），使熒光相對強度下降（P＜0.05）；野生型空病毒細胞組、突變型空病毒細胞組以及突變型過表達miR-21-5p細胞組（PDCD4突變序列插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因），后三組熒光相對強度無明顯變化。
　　結(jié)論：1、隨著時間的延長（0h-48h），未予干擾直接培養(yǎng)的細胞增殖活力逐漸增強，而經(jīng)過加入0.5mmol/L H

6、2O2培養(yǎng)、miR-21-5p慢病毒過表達載體+0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)和慢病毒空白載體+0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)的細胞增殖活力逐漸下降，說明H2O2及慢病毒均加快細胞損傷，其中miR-21-5p慢病毒過表達載體+0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)的細胞增殖活力下降較其他細胞組緩慢，miR-21-5p具有減輕細胞凋亡作用。 miR-21-5p過表達后的細胞組凋亡率較 H2O2損傷組和空病毒組下降，miR-21-5p具有抗凋