腸道微生態(tài)環(huán)境與兒童過敏性疾病的關(guān)系以及參芪健脾方對腸粘膜屏障功能修復(fù)和免疫功能調(diào)整的研究.pdf

1、在過去20年里，大量研究證實世界范圍內(nèi)過敏性疾病的發(fā)病率逐年增加，其原因不十分清楚。“衛(wèi)生假說”為兒童在生命早期缺乏微生物的暴露導(dǎo)致今后過敏性疾病的發(fā)生進行了解釋，由于缺乏微生物刺激導(dǎo)致Th1/Th2平衡紊亂和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能低下。越來越多研究認(rèn)為，兒童早期缺乏微生物接觸導(dǎo)致的過敏與今后發(fā)生哮喘和過敏性疾病的風(fēng)險密切相關(guān)。雖然過敏和哮喘具有遺傳傾向性，但基因與環(huán)境的相互作用更能解釋發(fā)病機制。環(huán)境因素如感染、接觸過敏原以及產(chǎn)前因素如母親吸

2、煙、孕期營養(yǎng)、產(chǎn)婦精神壓力、分娩方式和新生兒期應(yīng)用抗生素等均會影響小兒今后過敏性疾病和支氣管哮喘的發(fā)生。通過基因與環(huán)境的相互作用、表觀遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)深入研究，力圖解開假定風(fēng)險與過敏性疾病和支氣管哮喘發(fā)生的關(guān)聯(lián)。有關(guān)哮喘和過敏性紫癜的流行病學(xué)資料、危險因素調(diào)查以及病理機制有待進一步解釋，了解這些機理對減少哮喘發(fā)生風(fēng)險及尋找切實有效的藥物干預(yù)微生態(tài)生境，調(diào)整免疫功能對過敏性疾病的預(yù)防是十分必要的。
　　 第一部分：腸道微生態(tài)學(xué)

3、變化、CD4+T細(xì)胞亞群及相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子在兒童支氣管哮喘病理機制中的調(diào)控作用
　　 目的：探討腸道微生態(tài)環(huán)境變化以及免疫網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中CD4+T亞群及相應(yīng)細(xì)胞因子和上游轉(zhuǎn)錄因子在支氣管哮喘病理機制中的相互調(diào)控作用。
　　 方法：采用流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）對47例支氣管哮喘患兒和32例健康對照組兒童外周血單個核細(xì)胞(Peripheral bloodmononuclearcell，PBMC)測定CD3+

4、CD8-INF-γ+IL-4-(Th1)、CD3+CD8-INF-γ-IL-4+( Th2)、CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg)和CD3+CD8-IL-17+( Th17)細(xì)胞百分比；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)測定血漿中細(xì)胞因子INF-γ、IL-4、TGF-β1和IL-17水平；T-bet是調(diào)控Th1細(xì)胞分化、GATA3是調(diào)控Th2細(xì)胞分化、Foxp3是調(diào)控調(diào)節(jié)性T

5、細(xì)胞分化、ROR-γt是Th17分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR)檢測外周血單個核細(xì)胞內(nèi)T-bet、GATA3、Foxp3和ROR-γtmRNA的表達(dá)；采用細(xì)菌16SrDNA方法測定糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌含量。
　　 結(jié)果：支氣管哮喘患兒在急性發(fā)作期時發(fā)生腸道菌群失調(diào)，表現(xiàn)在雙歧桿菌和乳酸桿

6、菌為代表的厭氧菌數(shù)量下降，大腸桿菌和腸球菌為代表的需氧菌數(shù)量變化不大，雙歧桿菌/大腸桿菌( Bifidobacteria/ escherichia coli，B/E)值下降。隨著治療和癥狀改善，恢復(fù)期時雙歧桿菌數(shù)量上升較其他細(xì)菌為快，但整體菌群結(jié)構(gòu)并未扶正。對于免疫學(xué)指標(biāo)的觀察發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘患兒在急性發(fā)作期時外周血PBMC中Th2和Th17細(xì)胞百分比以及血漿中Th2和Th17細(xì)胞因子IL-4和IL-17濃度均高于健康對照組；Th1和T

7、reg細(xì)胞百分比以及血漿中Th1和Treg細(xì)胞因子INF-γ和TGF-β1濃度均低于健康對照組，出現(xiàn)Th1/Th2和Treg/Th17失衡。緩解期Th2和Th17細(xì)胞百分比及血漿相應(yīng)細(xì)胞因子濃度隨疾病的回復(fù)而降低，但仍高于健康對照組，仍存在免疫紊亂。支氣管哮喘患兒Th1細(xì)胞與血漿中INF-γ濃度和外周血PBMC中T-bet表達(dá)呈正相關(guān)；Th2細(xì)胞與血漿中IL-4濃度和外周血PBMC中GATA3表達(dá)呈正相關(guān)；Treg細(xì)胞與血漿中TGF-β

8、1濃度和外周血PBMC中Foxp3表達(dá)呈正相關(guān)；Th17細(xì)胞與血漿中IL-17濃度和外周血PBMC中ROR-γt表達(dá)呈正相關(guān)，表明Th1/Th2和Treg/Th17主要受其特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。腸道菌群中B/E值與Th1/Th2和Tregs/Th17之間均呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論：Th1/Th2細(xì)胞分化失衡在支氣管哮喘發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，除了Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答活躍外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及Th17細(xì)胞也參與了在支氣管哮喘的發(fā)病過程

9、中，表明除了經(jīng)典的Th1/Th2免疫失衡外，還存在Treg/Th17免疫失調(diào)。腸道共生菌刺激機體免疫系統(tǒng)的發(fā)育，在支氣管哮喘中通過下調(diào)Th2應(yīng)答，糾正Th1/Th2失衡。腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的完整性對維系CD4+CD25+T細(xì)胞功能發(fā)重要作用，支氣管哮喘患兒腸道菌群失調(diào)損傷了CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制功能，導(dǎo)致免疫耐受被打破是支氣管哮喘病理過程的重要機制。其研究結(jié)論為今后藥品的開發(fā)和應(yīng)用，并在早期及時恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡，阻斷異常免

10、疫的某個環(huán)節(jié)，防治支氣管哮喘提供了重要理論依據(jù)。
　　 第二部分：腸粘膜屏障功能、CD4+T細(xì)胞亞群及相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子在兒童過敏性紫癜病理機制中的調(diào)控作用
　　 目的：探討腸粘膜屏障功能變化及其免疫網(wǎng)絡(luò)中CD4+T亞群及相應(yīng)細(xì)胞因子和特異性轉(zhuǎn)錄因子在過敏性紫癜病理機制中的相互調(diào)控作用。
　　 方法：采用流氏細(xì)胞術(shù)測定41例過敏性紫癜患兒和30例健康兒童外周血單個核細(xì)胞CD3+CD8-INF-γ+IL-4-(Th1)，

11、CD3+CD8-INF-γIL-4+(Th2)，CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg)和CD3+CD8-IL-17+(Th17)細(xì)胞百分比；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血漿中INF-γ、IL-4、TGF-β1、IL-9和IL17細(xì)胞因子水平；T-bet是調(diào)控Th1細(xì)胞分化，GATA3是調(diào)控Th2細(xì)胞分化，F(xiàn)oxp3是調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化，ROR-γt是控制Th17分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，由逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測外周

12、血PBMC內(nèi)T-bet、GATA3、Foxp3和ROR-γtmRNA表達(dá)；采用細(xì)菌16SrDNA方法測定糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌含量。采用液相色譜儀測定尿中乳果糖(lactulose，L)與甘露醇(mannito，M)水平，計算L/M值評價腸粘膜通透性。
　　 結(jié)果：過敏性紫癜患兒在急性期即發(fā)生腸道菌群失調(diào)，表現(xiàn)為腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌下降，大腸桿菌和腸球菌減少不明顯，以乳酸桿菌數(shù)量下降為顯著。治療后隨著臨床

13、癥狀的改善，恢復(fù)期時雙歧桿菌數(shù)量上升較乳酸桿菌為快，腸道仍處于微生態(tài)紊亂狀態(tài)，并且腸道中乳酸桿菌數(shù)量和B/E值和尿L/M值呈負(fù)相關(guān)。在過敏性紫癜急性期時，外周血PBMC中Th2和Th17細(xì)胞亞群百分比以及血漿中IL-4、IL-17水平和特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3、ROR-γtmRNA表達(dá)均高于健康對照組；Th1和Treg細(xì)胞百分比以及血漿中INF-γ、TGF-β1水平和特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Foxp3mRNA表達(dá)均低于健康對照組，出現(xiàn)

14、Th1/Th2和Treg/Th17免疫失衡。恢復(fù)期時Th2和Th17細(xì)胞百分比及IL-4、IL-17水平和特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3和ROR-γt表達(dá)有所下降，但仍存在Th1/Th2、Treg/Th17免疫失衡。過敏性紫癜患兒血漿中INF-γ與外周血PBMC中Th1細(xì)胞百分比、T-bet表達(dá)呈正相關(guān)；IL-4與外周血PBMC中Th2細(xì)胞百分比、GATA3表達(dá)呈正相關(guān)；TGF-β1與外周血PBMC中Treg細(xì)胞百分比、Foxp3表達(dá)呈正相關(guān)

15、；IL-17與外周血PBMC中Th17細(xì)胞百分比、ROR-γt表達(dá)呈正相關(guān)。腸道菌群中B/E值和乳酸桿菌數(shù)量分別與Th1/Th2和Tregs/Th17呈正相關(guān)，與尿L/M比值呈負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：過敏性紫癜患兒在急性期出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡，表現(xiàn)在腸道菌群B/E值下降，乳酸桿菌數(shù)量下降尤為顯著，腸粘膜通透性下降，腸粘膜屏障功能遭到損壞，腸道共生菌所誘導(dǎo)的免疫耐受機制被打破，表現(xiàn)在外周血PBMC中CD4+CD25+T細(xì)胞百分比降低及

16、其血漿TGF-β1水平降低，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)下降，對以往經(jīng)典的Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡的發(fā)病理論進行了修訂，認(rèn)為過敏性紫癜的發(fā)病機制除了有Th1/Th2免疫失衡外，也存在Treg/Th17的免疫失調(diào)，并參與了疾病的病理過程。腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌在恢復(fù)機體免疫自穩(wěn)狀態(tài)，誘導(dǎo)免疫耐受方面發(fā)揮重要作用。研究結(jié)論從微生態(tài)學(xué)和免疫學(xué)角度闡明了過敏性紫癜的發(fā)病機制，探討了腸道共生菌、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子以及轉(zhuǎn)錄因子在疾病發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用

17、，為今后藥品的開發(fā)不僅限于調(diào)整宿主的免疫功能，更要放眼于改善腸道微生態(tài)環(huán)境，為過敏性紫癜的臨床治療提供前期的理論依據(jù)。
　　 第三部分參芪健脾方對腸道菌群失調(diào)大鼠腸粘膜屏障功能修復(fù)及免疫功能調(diào)整作用機制的實驗研究
　　 目的：前兩部分研究已表明兒童過敏性疾病如支氣管哮喘和過敏性紫癜的病理過程均發(fā)生腸道微生態(tài)失調(diào)和免疫調(diào)控機能失衡，故尋求改善微生態(tài)生境，調(diào)節(jié)免疫功能的藥物，早期阻斷疾病的惡性循環(huán)，防治過敏性疾病十分重要。本

18、實驗探討參芪健脾方對腸道菌群失調(diào)大鼠修復(fù)腸粘膜屏障功能、抑制腸道細(xì)菌移位和調(diào)整免疫功能的作用機制研究，對開發(fā)中藥方劑防治過敏性疾病具有重要臨床價值。
　　 方法：采用細(xì)菌培養(yǎng)法動態(tài)測定大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化及腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和結(jié)腸組織的移位細(xì)菌量；應(yīng)用光鏡和電子顯微鏡觀察大鼠腸粘膜組織超微結(jié)構(gòu)變化；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)動態(tài)測定大鼠腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和腸粘膜組織中Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

19、>　　 結(jié)果：腸道菌群失調(diào)模型建立，大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸桿菌數(shù)量均較對照組下降。腸粘膜組織受損，表現(xiàn)在腸絨毛、腸上皮細(xì)胞以及緊密連接的受損。大鼠體內(nèi)Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平早期受抑制，腸系膜淋巴結(jié)、腸粘膜、肝臟和脾臟組織出現(xiàn)腸道細(xì)菌移位情況。大腸桿菌攻擊可加重腸道菌群失調(diào)和腸粘膜損傷程度，上調(diào)Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平，加劇細(xì)菌移位程度。參芪健脾方和乳酸桿菌可減輕由腸道菌群失調(diào)引起的Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄受抑

20、及細(xì)菌移位程度，扶正腸菌群結(jié)構(gòu)，修復(fù)損傷的腸粘膜屏障功能。
　　 結(jié)論：闡明了腸道菌群、腸粘膜屏障功能和腸道細(xì)菌移位以及免疫功能之間的互為因果，相互影響的關(guān)系。腸道菌群失調(diào)改變了腸道微生態(tài)生境，損傷了腸粘膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促發(fā)腸道細(xì)菌移位，致使Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄受抑。參芪健脾方在維護機體微生態(tài)平衡、修復(fù)腸粘膜屏障功能和抑制腸道細(xì)菌移位方面相同于乳酸桿菌制劑，參芪健脾方可調(diào)整機體免疫功能，尤其是天然免疫的模式識別受體，對于過