咪唑啉Ⅰ-,1-受體穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)的建立及其功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的初步研究.pdf

1、咪唑啉受體(ImidazolineReceptor,IR)是八十年代以來逐漸被認(rèn)識(shí)的一種新型受體，目前證實(shí)IR主要分為I1R和I2R兩大類。I1R參與體內(nèi)許多重要的生理功能，如血壓調(diào)節(jié)，胰島素分泌等，并參與了抑郁癥、早老性癡呆等疾病的病理過程，已成為新的治療靶標(biāo)。國(guó)際上對(duì)I1R的研究工作尚處于初級(jí)階段，研究中遇到的最大困難之一是缺少單獨(dú)研究I1R的合適的細(xì)胞模型。如能建立合適的I1R細(xì)胞模型，有助于I1R的生物學(xué)功能及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究

2、，有助于開發(fā)新型藥物。 Piletz用兩種IR蛋白抗血清從人腦海馬λgt11cDNA文庫中，成功克隆了全長(zhǎng)5131bp的I1R-cDNA序列，并將其構(gòu)建為重組質(zhì)粒。我們用[3H]-咪唑克生特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明在1-48nM范圍內(nèi)，中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞未表現(xiàn)出α2腎上腺素受體(α2R)和I1R的結(jié)合位點(diǎn)，可用于建立專一表達(dá)I1R的細(xì)胞模型。 本研究用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將I1R重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。以氨基糖苷磷

3、酸轉(zhuǎn)移酶(neo，G418)為選擇標(biāo)記，篩選出34株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了I1R重組質(zhì)粒的CHO單克隆細(xì)胞系。以與標(biāo)記配體[3H]-咪唑克生是否有特異性結(jié)合為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在34株細(xì)胞中初篩發(fā)現(xiàn)19株細(xì)胞不同程度地表達(dá)了I1R。以與標(biāo)記配體3H-咪唑克生特異性結(jié)合值的高低為篩選標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)篩得到7株細(xì)胞有較高水平的表達(dá)。繼續(xù)篩選得到I1R-19和I1R-6兩株細(xì)胞系。選取I1R-19細(xì)胞株進(jìn)行進(jìn)一步研究。 經(jīng)受體飽和實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)I1R-19細(xì)胞株制備

4、的膜蛋白與標(biāo)記配體[3H]-咪唑克生和[3H]-可樂定的結(jié)合均具有特異性、可飽和性，且對(duì)兩種標(biāo)記配體的親和力大小和受體密度相同([3H]-咪唑克生：Kd=15.8±10.4nM，Bmx=713.3±102fmol/mg·蛋白；[3H]-可樂定：Kd=16.7±3.7nM，Bmax=742±17fmol/mg·蛋白)。采用全細(xì)胞受體飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)也可得到相似結(jié)果([3H]-咪唑克生：Kd=23.1±2.9nM，Bmax=178.4±7.4f

5、mol/106細(xì)胞；[3H]-可樂定：Kd=23.3±10.4nM，Bmax=122.1±1.6fmol/106細(xì)胞)。不同配體的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)表明IR激動(dòng)劑莫索尼定和可樂定，拮抗劑咪唑克生均能抑制I1R-19細(xì)胞與[3H]-可樂定的結(jié)合，而α2R受體激動(dòng)劑NE不能競(jìng)爭(zhēng)抑制I1R-19細(xì)胞與[3H]-可樂定的結(jié)合。進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染得到的配體結(jié)合位點(diǎn)具有I1R結(jié)合位點(diǎn)的特征。經(jīng)反復(fù)凍融，I1R-19細(xì)胞株傳代至45代后，與I1R配體[3H]-

6、可樂定的特異結(jié)合能力基本不變，表明獲得轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株是穩(wěn)定的。我們將這一新的I1R哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)命名為CHO-I細(xì)胞。 功能研究表明CHO-I細(xì)胞在正常血清的培養(yǎng)條件下，與CHO細(xì)胞比較生長(zhǎng)曲線無差異。但在缺乏血清的培養(yǎng)條件下，CHO-I細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的逆境生存和生長(zhǎng)能力。而且CHO-I細(xì)胞較CHO細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的對(duì)抗谷氨酸損傷的能力。此外，I1R的內(nèi)源性配體胍丁胺作用于CHO-I細(xì)胞，可使CHO-I細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，在0

7、.1～5μM范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，而且此作用可被10μM的依法克生部分阻斷。提示胍丁胺是通過激活I(lǐng)1R發(fā)揮作用的。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CHO-I細(xì)胞中的I1R可能具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖活性的功能。 [35S]-GTPγS結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可樂定不能刺激CHO-I細(xì)胞中的G蛋白與[35S]-GTPγS的結(jié)合，提示I1R可能不是G蛋白偶聯(lián)受體。此外，采用激光共聚焦和流式細(xì)胞儀方法研究了I1R配體胍丁胺、莫索尼定和可樂定對(duì)CHO-I細(xì)胞