菌株鑒定和Ⅱ型聚酮途徑阻斷對利迪鏈菌素生產(chǎn)的影響.pdf

1、本課題組從土壤中篩選得到了一株能夠產(chǎn)生某種具有較強抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及考克斯病毒活性化合物的鏈霉菌.前期的前體添加以及同位素標記實驗表明,該化合物是由Ⅰ型聚酮合成途徑產(chǎn)生的復合聚酮類化合物.然而由于該菌株中的化合物產(chǎn)量極低,不利于該化合物的結構鑒定和進一步的生物合成反應研究. 本文首先進行了該鏈霉菌的菌株鑒定工作,在了解生理、生化特性的基礎上,從分子分類學的角度探討該菌株的分類學地位.利用放線菌的一對16S rDNA

2、通用引物,從試驗菌株染色體上克隆了該菌株16S rDNA的1454bp的序列,幾乎達到了16S rDNA的全長.Blast分析結果顯示,該菌株的16S rDNA與利迪鏈霉菌DSM40461的16S rDNA高度同源.在所克隆的1454bp基因中,只有2個堿基的差異.PCR克隆該菌株的一個P450單氧化酶基因,結果發(fā)現(xiàn)它與利迪鏈霉菌AS4.2501中的相應基因僅有94﹪的同源性.且兩個菌株在生理、生化指標上也存在一定的差異.進一步實驗顯示

3、該菌株與利迪鏈霉菌DSM40461都產(chǎn)生一種次級代謝產(chǎn)物利迪鏈菌素.證明該菌株為利迪鏈霉菌的一個變種,命名為利迪鏈霉菌AS4.2501. 利迪鏈霉菌可產(chǎn)生多種有價值的次生代謝產(chǎn)物,包括利迪鏈菌素和利迪霉素,其中利迪鏈菌素是由Ⅰ型聚酮途徑產(chǎn)生的一種聚酮類化合物,它與另一類Ⅱ 型聚酮途徑競爭相同或相似的底物.由于Ⅰ型聚酮途徑和Ⅱ型聚酮途徑在基因進化角度存在某種聯(lián)系,Ⅰ型聚酮途徑與Ⅱ型聚酮途徑在代謝方面也具有某種密切的聯(lián)系.本

4、文以利迪鏈霉菌AS4.2501中所產(chǎn)生的利迪鏈菌素為例,研究了Ⅱ型聚酮途徑阻斷對利迪鏈菌素生產(chǎn)的影響.首先,從利迪鏈霉菌AS4.2501染色體上克隆了Ⅱ型聚酮途徑的KS.基因的部分片段；然后利用同源單交換原理通過鏈霉菌一大腸桿菌穿梭質粒pKC1139阻斷了Ⅱ型聚酮途徑的KS.基因；最后,應用高效液相色譜以及液相-質譜聯(lián)分析阻斷株的發(fā)酵產(chǎn)物.分析結果表明,Ⅱ型聚酮途徑的阻斷極大得提高了利迪鏈菌素的產(chǎn)量,提高了50﹪.另外,得到的阻斷菌株與