Ⅰ、CD133在人結(jié)腸癌細胞分化中的作用研究;Ⅱ、熒光標記腫瘤轉(zhuǎn)移體內(nèi)模型的建立.pdf

1、本論文分為兩個部分：
　　 第一部分：CD133在人結(jié)腸癌細胞分化中的作用
　　 在本研究中，首先我們用Western blotting檢測了44種人腫瘤細胞系中CD133的表達，其中8種細胞呈CD133陽性表達，5個來源于結(jié)腸癌。接著我們分選了結(jié)腸癌細胞系HCT116中CD133high和CD133。的亞群，發(fā)現(xiàn)CD133high的HCT116細胞在體外生長快于CD133-的HCT116細胞，并有更高的克隆形成率。CD

2、133high亞群和CD133-的HCT116亞群細胞相比，S期和G2/M期細胞比例更高。但是在BALB/c-nu/nu鼠成瘤實驗中，CD133high/+和CD133-的HCT116細胞并沒有明顯的區(qū)別。將分選后的CD133high/+和CD133-的HCT116細胞體外培養(yǎng)，CD133的分布趨向于和未分選前的HCT116細胞相同。我們的研究結(jié)果提示不能單用CD133一個分子標記來富集結(jié)腸癌細胞系中的腫瘤干細胞。
　　 我們進

3、一步研究了CD133的表達和結(jié)腸癌分化的關系。我們按照CD133的表達量，將結(jié)腸癌細胞HT29分為了四個亞群，以ALP活性作為分化程度的指標進行了檢測，結(jié)果顯示不同亞群的分化狀態(tài)和CD133的表達呈負相關。我們還發(fā)現(xiàn)用丁酸鈉誘導HT29和HCT116分化后，流式檢測這兩種細胞表面的CD133/1和CD133/2的免疫活性都呈現(xiàn)時間和劑量依賴的下降。但是Western Blotting卻未檢測到細胞中CD133總蛋白水平的改變。我們還設計

4、了三對針對人CD133分子的siRNA，其中兩對可以在體外有效干擾CD133表達。但是干擾CD133的表達對HT29和HCT116細胞的增殖、克隆形成、周期分布和分化狀態(tài)都沒有明顯的影響。CD133可能不是細胞生長和分化的調(diào)控基因。
　　 總的來說，CD133不是結(jié)腸癌細胞系HCT116特異的腫瘤干細胞的標記，而只是結(jié)腸癌分化相關的一個指標。
　　 第二部分：熒光標記腫瘤轉(zhuǎn)移體內(nèi)模型的建立
　　 本研究通過轉(zhuǎn)染p

5、EGFP-N1質(zhì)粒，藥物篩選后無限稀釋得到了四株強表達綠色熒光蛋白的單克隆細胞株-人宮頸癌細胞HeLa-GFP、人結(jié)腸癌細胞HCT116-GFP、人乳腺癌細胞MDA-MB-231-GFP和小鼠宮頸癌細胞U14-GFP。
　　 我們把HeLa-GFP以8×106個/只的劑量皮下接種于BALB/c-nu/nu裸鼠，成瘤潛伏期是3-5天，成瘤率為100％。利用Photometrics活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，可以清楚直觀的觀察表達GF

6、P的HeLa-GFP移植瘤在體內(nèi)的生長。接種后第60天處死全部荷瘤鼠，解剖后大體成像僅有一只可見同側(cè)腋窩下淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。取U14-GFP以8×106個/只接種C57BL/6J小鼠，移植成瘤的潛伏期是2-4天，成瘤率100％。利用Photometrics活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，可分別在第22天、28天、37天和52天觀察荷瘤小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)展過程。在U14-GFP原發(fā)瘤體積≥5 cm3時，肺部和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率分別為67％和100％。我們還

7、將HCT116-GFP進行了皮下移植和尾靜脈注射，用Berthold活體成像儀觀察了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。利用Berthold活體成像系統(tǒng)可見HCT116-GFP移植瘤在體內(nèi)仍可強表達GFP。HCT116-GFP尾靜脈注射后第43天，可用Berthold活體成像系統(tǒng)檢測到GFP陽性的皮下轉(zhuǎn)移腫瘤。
　　 最后，我們還檢測了兩種常見的轉(zhuǎn)移相關分子CD44和E-cadherin在HeLa-GFP和U14-GFP細胞移植瘤中的表達。免疫組