骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)慢性阻塞性肺病氣道及肺實(shí)質(zhì)損傷的修復(fù)作用.pdf

1、慢性阻塞性肺病(COPD)是人類(lèi)的常見(jiàn)病，是世界范圍內(nèi)第四位的死亡原因。近年來(lái)，隨著環(huán)境污染等因素的加重，其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。COPD以不完全可逆的氣流受限為特征，病情呈進(jìn)行性發(fā)展，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病理學(xué)改變則累及肺臟的多級(jí)結(jié)構(gòu)，包括中央及周?chē)臍獾?、肺?shí)質(zhì)乃至肺血管。目前認(rèn)為，COPD的病理?yè)p傷屬于不可逆性病變，依靠機(jī)體自身的能力無(wú)法達(dá)到組織的完全修復(fù)。因此，迫切需要尋找到一種參與肺部組織結(jié)構(gòu)的修復(fù)和重建的有效方法。 研

2、究認(rèn)為，骨髓中的造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcells，HSC)和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)都具有多向分化的潛能，其中MSC由于取材方便、來(lái)源豐富、容易培養(yǎng)、增殖力旺盛而日益成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)大量研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞在治療諸如糖尿病、心肌梗塞、移植物抗宿主反應(yīng)等多種疾病方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。 之前有研究已證實(shí)，骨髓MSC可以在體內(nèi)、體外分化為肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞

3、，在炎癥等因素的趨化下，外源的骨髓MSC有向肺損傷部位匯集的現(xiàn)象。外源MSC可能通過(guò)兩方面參與肺的損傷修復(fù)：1．在局部微環(huán)境作用下誘導(dǎo)分化為肺泡上皮和支氣管上皮細(xì)胞等結(jié)構(gòu)細(xì)胞，參與組織的修復(fù)過(guò)程；2．通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用，為損傷修復(fù)提供的有利環(huán)境。 但目前而言，應(yīng)用MSC干預(yù)治療COPD的相關(guān)研究十分少見(jiàn)，現(xiàn)有的關(guān)于肺部疾病干細(xì)胞治療的有限相關(guān)研究，主要集中在急性肺實(shí)質(zhì)損傷和肺纖維化方面。而且，對(duì)于不同移植條件對(duì)干細(xì)胞治療效果也沒(méi)有

4、相應(yīng)的對(duì)比研究。因此，本課題經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的對(duì)比和系統(tǒng)的觀(guān)察，研究觀(guān)察了移植的骨髓MSC在COPD動(dòng)物模型肺局部的定植存活情況，了解MSC移植的治療效果。本研究包括三部分內(nèi)容，分述如下。 一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性 目的：分離和培養(yǎng)大鼠MSC(rMSC)，研究其生物學(xué)特征，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。 方法：取6-8周齡正常雄性Wistar大鼠的股骨和肱骨，無(wú)菌狀態(tài)下沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸液，接種于塑料培

5、養(yǎng)皿，使用10％FBS/DMEM-LG的培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2和100％飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每3-4d按照1：3進(jìn)行常規(guī)方法傳代；倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記和細(xì)胞周期；定向誘導(dǎo)rMSC在體外向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化；裸鼠皮下注射rMSC檢測(cè)其成瘤性。 結(jié)果：體外培養(yǎng)的rMSC大部分呈梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞呈輻射狀排列。在體外觀(guān)察傳代20代，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速

6、度無(wú)明顯改變；生長(zhǎng)匯合率達(dá)30％-40％和90％時(shí)的P5代rMSC，G0/G1期細(xì)胞的百分比分別為53.07％和85.24％，S+G2+M期細(xì)胞的百分比分別為46.93％和14.76％：P5代細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44．和Sca-1，而不表達(dá)造血干細(xì)胞的標(biāo)記CD34、CD117和CD45，不表達(dá)FIk-1、MHC-Ⅱ；在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)下，rMSC可向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，具有多向分化潛能；裸鼠背部種植rMSC，3個(gè)月未見(jiàn)成瘤現(xiàn)象。

7、 結(jié)論：全骨髓貼壁法可成功分離和培養(yǎng)出大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分離所得的細(xì)胞性狀穩(wěn)定、狀態(tài)良好，形態(tài)學(xué)和表型符合間充質(zhì)干細(xì)胞特點(diǎn)，具有多向分化潛能且無(wú)明顯成瘤性。 二、COPD模型的構(gòu)建和鑒定 目的：研究建立合理的慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠模型的有效方法。 方法：8周齡健康Wistar大鼠15只，隨機(jī)分入健康對(duì)照組(C組)和兩個(gè)COPD模型組。用兩次氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS200μg/次)加熏香煙1個(gè)月的復(fù)

8、合刺激法(A組)和單純熏煙法(B組)分別建立大鼠COPD模型，然后行病理學(xué)檢測(cè)造模效果，包括平均內(nèi)襯間隔(MLI)和平均肺泡數(shù)(MAN)的測(cè)定；觀(guān)察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況：檢測(cè)動(dòng)物的外周血常規(guī)和支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)。 結(jié)果：兩COPD模型組大鼠納差消瘦，伴有間歇咳嗽和氣促。病理學(xué)檢查顯示兩模型組均具有慢性支氣管炎和肺氣腫的典型病變。兩模型組外周血和BALF中的白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞百分比均較健康對(duì)照組顯著增高(P

9、＜0.01)；兩模型組MLI較對(duì)照組有顯著性增高，而MAN較對(duì)照組顯著性下降(P＜0.01)；但A、B兩組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。病理學(xué)切片上，A組比B組各級(jí)支氣管及肺組織的炎癥浸潤(rùn)更明顯，上皮細(xì)胞損傷和腺體增生明顯；而B(niǎo)組更突出表現(xiàn)為肺泡的過(guò)度擴(kuò)大融合。 結(jié)論：用單純熏煙法和兩次氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS200μg/次)加熏香煙的方法，均可成功制備大鼠COPD模型，其病理生理改變與人類(lèi)COPD類(lèi)似，后者比前者更符合COPD

10、自然發(fā)病過(guò)程。 三、MSC在COPD大鼠模型肺部的定植分化與治療作用 目的：觀(guān)察rMSC移植在COPD動(dòng)物肺部的定植和分化及其治療作用。 方法：選健康雌性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為5組：rMSC小劑量/單次尾靜脈移植組(A組，12只，COPD大鼠，尾靜脈輸注rMSC1×106/1ml)；rMSC大劑量/兩次尾靜脈移植組(B組，12只，COPD大鼠，尾靜脈輸注rMSC1×106/1ml×2次)；rMSC對(duì)照組

11、(C組，4只，正常大鼠，處理同A組)；COPD模型組(D組，4只，尾靜脈輸注生理鹽水1ml)；健康對(duì)照組(E組，4只)。體外培養(yǎng)擴(kuò)增雄性Wistar大鼠來(lái)源的rMSC，以CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞后將其經(jīng)尾靜脈注入用熏煙加LPS氣管注入法制作的同系雌性COPD大鼠模型體內(nèi)，在注射后的1d、7d、15d、30d分別處死動(dòng)物，取新鮮肺組織冰凍切片熒光顯微鏡下觀(guān)察Dil陽(yáng)性細(xì)胞定植、分布和存活時(shí)間；原位雜交法檢測(cè)肺組織中外源細(xì)胞的定位、定植效率，以

12、及形態(tài)學(xué)觀(guān)察和在肺外臟器的分布：CM-Dil聯(lián)合免疫組化法檢測(cè)rMSC在肺組織的轉(zhuǎn)分化情況；觀(guān)察肺組織病理學(xué)變化以及血常規(guī)、肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)；使用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)COPD大鼠BALF和外周血中IL-10、TNF-α和G-CSF的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SSPS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水平為α=0.05。 結(jié)果：(1)熒光顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，A、B兩組在進(jìn)行rMSC移植后，肺組織內(nèi)有較多的CM-Di

13、l陽(yáng)性細(xì)胞(紅色熒光)進(jìn)入，主要分布于肺間質(zhì)、肺泡和氣道壁，并可在肺局部存留30d以上；而C組肺組織內(nèi)偶見(jiàn)少量熒光陽(yáng)性細(xì)胞；未經(jīng)rMSC移植的D、E組肺組織內(nèi)未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。(2)原位雜交結(jié)果與CM-Dil檢測(cè)結(jié)果類(lèi)似，并可見(jiàn)原位雜交陽(yáng)性的細(xì)胞光鏡下呈現(xiàn)Ⅱ型肺泡上皮和氣道粘膜上皮形態(tài)，血管平滑肌細(xì)胞也可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞；心臟、骨骼肌和肝臟等肺外組織未見(jiàn)或極少見(jiàn)外源細(xì)胞；A、B兩組肺組織內(nèi)的外源細(xì)胞定植效率無(wú)明顯差異。(3)CM-Dil染色聯(lián)

14、合免疫組化檢測(cè)提示，部分CM-Dil陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)有免疫組化檢測(cè)SPC或CC16表達(dá)陽(yáng)性，提示外源細(xì)胞部分轉(zhuǎn)分化為Ⅱ型肺泡上皮和氣道粘膜上皮。(4)A、B組外周血和BALF中的白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞分類(lèi)較D組有顯著降低(P＜0.01)，但仍高于C和E組(P＜0.01)，提示rMSC移植后COPD炎癥水平有所下調(diào)。(5)A、B組外周血和BALF中的IL-10較D組有顯著性升高(P＜0.01)，但低于C和E兩組(P＜0.01)；TNF-α和G