新型吡唑啉酮衍生物抗腫瘤作用及機制研究.pdf

1、目的： 本研究對一系列吡唑啉酮衍生物(Lgf-YL)在四種人類腫瘤細胞HepG2、OVCAR3、KB及KBv200進行體外篩選，發(fā)現(xiàn)一種吡唑啉酮水楊酰肼席夫堿類化合物(Lgf-YL-9)的細胞毒活性最為顯著，從而進一步就Lgf-YL-9對人口底癌KB細胞及其MDR KBv200細胞的體內外抗增殖活性及分子機制進行研究。 方法： 采用MTT法對13種吡唑啉酮衍生物進行細胞毒測定及體外篩選；裸鼠移植瘤實驗研究Lgf-

2、YL-9對KB及KBv200細胞裸鼠移植瘤的抗增殖作用；光鏡及熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞形態(tài)；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA ladder及藥物與DNA反應測定；Annexin V-PI雙染法分析細胞凋亡率；流式細胞儀檢測△ψ m及細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)的變化；Western Blot研究細胞凋亡途徑及分子機制。 結果： 1、吡唑啉酮衍生物的抗增殖作用。吡唑啉酮衍生物

3、對HepG2、OVCAR3、KB及KBv200細胞的體外篩選Lgf-YL-2、-5、-13對四種腫瘤細胞無細胞毒活性(IC<,50>>100μg/ml)。Lgf-YL-7、-12對HepG2和KBv200細胞有微弱的細胞毒活性。Lgf-YL-1、-3對HepG2細胞以及Lgf-YL-6、-8對KB細胞無細胞毒活性(IC<,50>>100μg/mL)，對其他三種細胞的細胞毒活性較弱。Lgf-YL-4、-11對四種細胞展現(xiàn)了中等程度的細胞毒

4、活性。值得注意的是Lgf-YL-9、-10對四種腫瘤細胞顯示了顯著的細胞毒活性，尤其是Lgf-YL-9的細胞毒活性最強，而且Lgf-YL-9對KBv200細胞的細胞毒活性是Lgf-YL-10的八倍，以上結果表明Lgf-YL-9作為一種新型的抗癌物質值得被進一步研究。 Lgf-YL-9在體內外對KB和KBv200細胞的抗增殖作用體外MTT測定結果Lgf-YL-9對KB和KBv200細胞的IC<,50>值分別為3.81±0.02μg

5、/ml和3.45±0.03μg/ml，兩者在統(tǒng)計學上差異無顯著性。體內抑瘤實驗結果顯示給藥濃度為1.5、3、6 mg/kg的Lgf-YL-9對KB及KBv200細胞移植瘤的抑瘤率分別為22.98﹪、34.68﹪、43.15﹪及25.37﹪、38.43﹪、47.50﹪。 2、Lgf-YL-9誘導細胞凋亡的作用本研究采用多種實驗方法檢測Lgf-YL-9誘導細胞凋亡的作用。光鏡下觀察到Lgf-YL-9對四種腫瘤細胞的損傷呈濃度依賴性增

6、大。12μg/mL的Lgf-YL-9作用于KB及KBv200細胞24小時后，Hoechst 33258染色在熒光顯微鏡下可見對照組細胞呈均勻彌散藍色熒光，凋亡細胞呈濃染致密的顆粒狀熒光，并有典型的凋亡小體形成。采用DNA瓊脂糖凝膠電泳實驗證實Lgf-YL-9能誘導KB和KBv200細胞的DNA出現(xiàn)凋亡相關的DNA ladder改變并呈現(xiàn)時間和濃度依賴性遞增。Annexin V-PI雙染測定Lgf-YL-9對KB及KBv200細胞的凋亡率

7、，結果顯示Lgf-YL-9對這兩種腫瘤細胞的凋亡作用相近。 3、Lgf-YL-9誘導細胞凋亡的機制探討。 Lgf-YL-9誘導的細胞凋亡可能不是通過與DNA發(fā)生嵌合作用為探討Lgf-YL-9誘導的細胞凋亡是否與LgfoyL-9和DNA發(fā)生嵌合反應有關，采用藥物與DNA反應測定實驗，結果證實在Lgf-YL-9與DNA的反應體系中，不同濃度的Lgf-YL-9分別作用于KB和KBv200細胞不同時間后，DNA熒光強度與對照相比

8、無改變。在表阿霉素(Epirubicin，EDR)作用下，DNA熒光強度與對照相比呈濃度和時間依賴性降低。結果提示EDR能夠與KB和KBv200細胞的DNA發(fā)生嵌合反應，而Lgf-YL-9可能不與KB和KBv200細胞的DNA發(fā)生嵌合反應。 Lgf-YL-9可能不是通過死亡受體途徑誘導細胞凋亡為探討Lgf-YL-9誘導的細胞凋亡是否與死亡受體途徑有關，采用WestemBlot方法檢測死亡受體途徑的啟動Caspase即Caspas

9、e-8，結果在KB及KBv200細胞均未檢測到Caspase-8的激活裂解帶。 Lgf-YL-9是通過非依賴ROS升高的線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡Lgf-YL-9誘導的凋亡是否與線粒體凋亡途徑有關呢?采用DiOC<,6>(3)熒光染料對△ψm進行檢測，結果顯示不同濃度的Lgf-YL-9分別作用KB和KBv200細胞24小時后，兩種細胞的△ψm均呈濃度依賴性下降。Western Blot進一步測定細胞內Cyto-C含量及Caspa

10、se-9、-3、-7及多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)，結果顯示不同濃度Lgf-YL-9作用KB和KBv200細胞24小時后，胞漿Cyto-C均呈濃度依賴性聚集并誘導了凋亡相關蛋白的激活。采用DCFH-DA熒光染料對細胞內ROS進行檢測，結果顯示12μg/ml的Lgf-YL-9作用KB和KBv200細胞24小時后，兩種細胞內的ROS與對照組相比呈顯著性下降。 Lgf-YL-9

11、可以調節(jié)Bcl-2家族主要蛋白的表達Bcl-2家族成員與線粒體凋亡途徑關系密切，我們采用Westem Blot方法檢測Bcl-2家族中幾個重要的成員：Bcl-2、Bcl-xL、Bax及Bad。不同濃度的Lgf-YL-9分別作用于KB和KBv200細胞24小時后，結果顯示Lgf-YL-9可以下調Bcl-2及Bcl-XL的表達，同時上調了Bad的表達，但對Bax的表達無影響。 3.3.5 Lgf-YL-9可能不作用于AKT及ERK-MAPK

12、信號轉導通路為探討Lgf-YL-9是否作用于細胞生長信號通路AKT及ERK-MAPK，不同濃度的Lgf-YL-9分別作用于KB和KBv200細胞24小時后，采用Western Blot方法檢測p-AKT、AKT及p-ERK1/2、ERK1/2的表達。結果證實在總的AKT及ERK1/2表達無變化的情況下，Lgf-YL-9沒有下調p-AKT及p-ERK1/2的表達。 4、Lgf-YL-9沒有下調KBv200細胞P-gp的表達為探討M

13、DR KBv200細胞對Lgf-YL-9不具有凋亡抗性的原因，采用WesternBlot方法檢測P-gp的表達，不同濃度的Lgf-YL-9分別作用于KB和KBv200細胞24小時后，結果顯示敏感株KB細胞中沒有P-gP的表達，Lgf-YL-9沒有改變MDR KBv200細胞中P-gP的表達。 結論： 1) 13種吡唑啉酮衍生物在四種人類腫瘤細胞體外篩選的結果證實Lgf-YL-9的細胞毒活性最為顯著。 2) 體內外

14、抗增殖實驗證實Lgf-YL-9對KB及MDR KBv200細胞具有相近的抗增殖活性。 3) Lgf-YL-9能夠誘導KB及MDR KBv200細胞凋亡。 4) Lgf-YL-9誘導的細胞凋亡途徑可能不是通過死亡受體途徑，而是通過非依賴ROS升高的線粒體途徑。 5) Lgf-YL-9能夠調節(jié)Bcl-2家族主要蛋白的表達；初步認為Lgf-YL-9不與DNA發(fā)生嵌合反應，也不作用于AKT及ERK-MAPK信號轉導通路。