苯甲酰脲衍生物F13的抗腫瘤作用及機制研究.pdf

1、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文苯甲酰脲衍生物F13的抗腫瘤作用及機制研究姓名：金海霞申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)指導(dǎo)教師：邵榮光;甄永蘇20090501在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)高濃度F 1 3 ( ≥5 p g ／m 1 ) 在給藥后2h 即可引起H T ．1 0 8 0細胞皺縮，變圓。2 ．5 “g ／m l 的F 1 3 在給藥后4 h 也可引起部分細胞發(fā)生類似的形態(tài)學(xué)變化。而lp g ／m l 的F 1 3

2、對細胞形態(tài)沒有明顯的改變。并且，H T 一1 0 8 0 細胞經(jīng)F 1 3短時間處理( 如2 h ，4 h ，6h ，8 h ，或2 4 h ) 后撤藥，換成新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至2 4h ，4 8 h ，或7 2h ，其生長抑制率與持續(xù)給藥組細胞沒有顯著差異。說明F 1 3 對H T ．1 0 8 0 細胞具有快速而不可逆轉(zhuǎn)的殺傷作用。文獻報道指出，細胞內(nèi)鈣離子過載或細胞內(nèi)外鈣離子平衡被打破時，可導(dǎo)致細胞毒作用，并誘發(fā)細胞凋亡或壞死。因

3、此，我們也檢測了F 1 3 對H T ．1 0 8 0 細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。流式細胞儀結(jié)果顯示，高濃度F 1 3 ( 5 l a g ／m l ，1 0I ．t g ／m 1 ) 在給藥后1h 即可引起細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。2 ．5I ．t g ／m l F 1 3 在給藥后4 h 后也引起細胞內(nèi)鈣離子濃度升高。而在整個過程中，lp t g ／m lF 1 3 處理的細胞，其細胞鈣離子濃度與對照組細胞相比，沒有發(fā)生明顯的變化。F

4、1 3 引起H T ．1 0 8 0 細胞內(nèi)鈣離子濃度隨時間的變化趨勢與我們先前觀察到的細胞形態(tài)變化趨勢一致，表明，F(xiàn) 1 3 引起的H T ．1 0 8 0 細胞殺傷作用可能與細胞內(nèi)鈣離子濃度的改變有關(guān)。我們進一步測定了F 1 3 對H T ．1 0 8 0 的增殖抑制作用。結(jié)果表明，F(xiàn) 1 3 對H T 一1 0 8 0的增殖抑制作用具有時間和劑量依賴性。濃度為2 ．5 ～5 ¨g ／m l 的F 1 3 可顯著抑制細胞的

5、生長，而濃度為0 ．5 ～1 I t g ／m l 的F 1 3 在第6 天以前，對細胞的生長不存在顯著性影響，該結(jié)果提示，小于1 “g ／m l 的濃度可能是一個亞毒性劑量，該濃度范圍被我們在后續(xù)實驗中用于研究F 1 3 對細胞運動、侵襲、和粘附能力的影響。對于F 1 3 引起的細胞凋亡，舢m e x i n ．V ／P I 雙染顯示，高濃度F 1 3 ( 2 ．5 和5g g ／m 1 )在1 2 h 和2 4 h 都引起H T l

6、 0 8 0 細胞早期凋亡和晚期凋亡比率增加；而1g t g ／m lF 1 3處理的細胞，在1 2h 和2 4 h 的凋亡比率與對照組相比都沒有出現(xiàn)明顯的變化。F 1 3濃度大于1g t g ／m l 時可引起H T ．1 0 8 0 細胞凋亡，這一結(jié)果同樣被T u n n e l 染色證實。W e s t e r n B l o t 結(jié)果顯示，F(xiàn) 1 3 處理濃度達到2 ．5u ∥m l 后，3 5 k D a 的c a s p a

7、 s e 3 蛋白水平下降，而P A R P 產(chǎn)生明顯的8 5 k D a 條帶，這一結(jié)果與F 1 3 引起的凋亡一致。在研究F 1 3 是否抑制細胞運動、侵襲和粘附能力時，我們首先確定了F 1 3 的H N T C ( H i g h e s tn o n —t o x i cc o n c e n t r a t i o n ) ，從而排除F 1 3 直接的生長抑制作用干擾實驗結(jié)果，結(jié)果表明，耋l g g ／m l 的F 1 3 濃

8、度屬于H N T C 范疇，該濃度被我們用于后續(xù)實驗。劃痕實驗和T r a n s w e l l 運動實驗表明F 1 3 ( 0 ．2 5 ～lI ，t g ／m 1 ) 劑量依賴性抑制H T ．1 0 8 0 細胞的運動能力，具有統(tǒng)計學(xué)意義?；贛 a t r i g e l 的T r a n s w e l l 侵襲實驗表明，F(xiàn) 1 3 ( O ．2 5 ～1 } t g ／m 1 ) 劑量依賴性抑制H T 一1 0 8 0 細胞