NO供體型樺木醇衍生物的合成及抗腫瘤機制的研究.pdf

1、目的:
　　樺木醇(Betulin，BT)，一種重要的羽扇豆烷型三萜化合物，具有抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗炎等廣泛的藥理活性。但BT存在著水溶性低、藥效不顯著等問題，限制了其在臨床上的應用。因此，為了獲得具有良好抗腫瘤活性的BT衍生物，本研究對系列樺木醇NO供體衍生物進行了合成，并研究了各衍生物體外NO釋放，選擇人肝癌細胞株Huh7和乳腺癌細胞株MCF-7評價化合物的增殖抑制作用，對潛在抗腫瘤作用衍生物的凋亡機制進行探討。

2、　　方法:
　　采用酯化、親核取代、自由基取代等對BT的C-3、C-28或/和C-30進行了修飾;Griess法測定了各衍生物體外NO釋放;MTT法及細胞克隆形成實驗評價了樺木醇NO供體衍生物對腫瘤細胞的增殖抑制活性;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡率;流式細胞技術檢測了樺木醇NO供體衍生物對細胞周期的影響及對線粒體膜電位的影響;免疫印跡技術檢測了對細胞周期蛋白（CDK1、CDC25C和CyclinB1）的表達

3、影響，對凋亡相關蛋白（Caspase3、Caspase9和PARP）的剪切情況;對線粒體調控蛋白(Bcl-2、Bax)及細胞色素c(Cyt c)釋放的作用;對PI3K/Akt信號通路表達改變的影響。
　　結果:
　　研究共合成7個NO供體的BT衍生物:3，28-二-[4-（2-硝氧基乙氧基）-1，4-丁二酰]-氧基樺木醇、3，28-二-[4-（4-硝氧基丁氧基）-1，4-順丁烯二酰]-氧基樺木醇、3，28-二-乙酰氧基-30

4、-硝氧基-樺木醇、3，28-二-{4-（8-硝氧-2，6-二氧二環(huán)[3.3.0]辛烷-4-氧）甲酰-苯甲酰氧基}-樺木醇、3，28-二-（2-硝氧基-乙酰氧基）-樺木醇、3，28-二-（2-硝氧基-丙酰氧基）-樺木醇、3，28-二-（2-硝氧基-異丁酰氧基）-樺木醇。所有的化合物均經紅外光譜、核磁共振（1H-NMR和13C-NMR）等技術手段鑒定.各個BT衍生物的NO釋放情況各不相同，大多數衍生物的NO釋放量隨時間的變化改變不大，可較快

5、達到平衡狀態(tài)。其中，3，28-二-（2-硝氧基-乙?；?氧基樺木醇具有良好的抗腫瘤活性，并成功抑制Huh7、MCF-7腫瘤細胞生長，呈劑量依賴性。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法證實3，28-二-（2-硝氧基-乙酰氧基）-樺木醇誘導Huh7細胞凋亡，通過調控Caspase家族蛋白通路來實現。其中Caspase3與Caspase9表達減少，而C-Caspase3和C-Caspase9表達明顯增加。此外，3，28-二-（2-硝氧基-

6、乙酰氧基）-樺木醇可使Huh7細胞阻滯于G2/M周期。JC-1檢測到線粒體跨膜電位的損失，且JC-1單體的綠色熒光表達從3.48％增加到23.4％，說明了化合物是通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，并影響線粒體調控蛋白的表達。研究中發(fā)現Bcl-2蛋白表達水平下降，而Bax表達水平增加，Cyt c從線粒體中大量釋放。Western Blotting結果顯示，3，28-二-（2-硝氧基-乙酰氧基）-樺木醇呈劑量依賴性地顯著降低了PI3K催化亞基p1