骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘生脂肪細(xì)胞及祛脂素去脂化作用的研究.pdf

1、目的：通過體外分離和濃聚成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，并研究祛脂素對此誘導(dǎo)分化過程的影響，進(jìn)一步研究觀察祛脂素在再生障礙性貧血的去脂化作用，為治療再生障礙性貧血開辟一條新途徑。 方法：1.取未累及骨髓的住院患者30例，中位年齡為53.6歲，再生障礙性貧血(AA)患者12例，中位年齡為56.4歲。常規(guī)抽取肝素抗凝骨髓液，收集單個核細(xì)胞層，按1×106cells/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶孵育，5天后更換培養(yǎng)液，棄去未貼

2、壁細(xì)胞，3～4天換液1次。實驗組：分別將傳至第1、3、5代的貼壁細(xì)胞按2×105/ml接種于6孔板，37℃,5﹪CO2，飽和濕度下孵育，24h后更換培養(yǎng)體系為含有終濃度為1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L的IBMX、10μg/ml牛胰島素、100mmol/L消炎痛、含10﹪FBS的高糖DMEM成脂誘導(dǎo)體系繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)3天，每隔3～4天換液1次。對照組：24h后更換含10μg/ml的牛胰島素、10﹪FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，每

3、隔3～4天換液1次。誘導(dǎo)后細(xì)胞用PBS洗滌3次，油紅O染色5～10min，光鏡下觀察。隨機(jī)數(shù)取10個非重疊視野(×100)，計算脂肪細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，結(jié)果用(X)±S表示；用免疫組化和RT-PCR方法測定兩組細(xì)胞PPARγ表達(dá)水平。 2.隨機(jī)分為兩組，一組為按上述方法繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)的成脂誘導(dǎo)組；另一組為在成脂誘導(dǎo)體系內(nèi)加入等體積的終濃度為1mg/ml的祛脂素的實驗組。兩組細(xì)胞的終濃度均為2×105/ml。觀察祛脂素對此誘導(dǎo)分化

4、的影響，光鏡下觀察細(xì)胞脂肪化程度，計算脂肪細(xì)胞陽性率；RT-PCR測定各組細(xì)胞PPARγ表達(dá)水平。 3.取12例AA患者肝素抗凝骨髓液各約10ml，收集單個核細(xì)胞層，洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml，每個AA患者的骨髓均分為等量的兩份，再隨機(jī)分為成脂對照組和祛脂實驗組：對照組為將終密度為2×106/ml的貼壁細(xì)胞加入上述成脂誘導(dǎo)體系內(nèi)；實驗組為將細(xì)胞終濃度為2×106/ml的貼壁細(xì)胞加入上述成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)體系和終濃度為1mg

5、/ml的祛脂素的混合培養(yǎng)基。接種于培養(yǎng)瓶中，370C,5﹪的CO2,飽和濕度下孵育。每3天半量換液一次。14天后收集培養(yǎng)細(xì)胞，在光鏡下觀察細(xì)胞脂肪滴情況和用RT-PCR方法檢測兩組細(xì)胞內(nèi)PPARγ表達(dá)情況。 結(jié)果：1.光鏡下觀察MSC誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的形態(tài)變化：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)體系加入后48h，成纖維樣長梭形細(xì)胞樣的MSC中有小脂滴出現(xiàn)，主要集中于細(xì)胞核周圍，隨著誘導(dǎo)時間的延長，小脂滴逐漸聚集成大的脂泡，細(xì)胞逐漸增大，由原來的梭形變?yōu)?/p>

6、圓形或多角形。不同代的細(xì)胞誘導(dǎo)脂肪的發(fā)生率沒有明顯的區(qū)別。對照組誘導(dǎo)3周后無變化，細(xì)胞內(nèi)沒有脂滴形成。用油紅O染色顯示誘導(dǎo)組細(xì)胞有棕紅色脂肪滴形成；而對照組則沒有棕紅色脂滴形成。誘導(dǎo)劑組脂肪細(xì)胞陽性率為86.4﹪±3.2﹪；正常對照組的脂肪細(xì)胞陽性率為0﹪，兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。誘導(dǎo)組細(xì)胞PPARγ表達(dá)水平比正常組PPARγ表達(dá)水平明顯增高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。 2.PPARγ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：誘導(dǎo)

7、組見棕黃色顆粒主要分布在細(xì)胞胞核內(nèi)，胞漿偶可見，與對照組相比，誘導(dǎo)組細(xì)胞PPARγ陽性表達(dá)細(xì)胞明顯增多(P＜0.01)。 3.Westernblot及RT-PCR測定PPARγ蛋白和PPARγmRNA的表達(dá)：誘導(dǎo)組細(xì)胞PPARγ的表達(dá)水平明顯高于對照組(P＜0.01)；誘導(dǎo)組PPARγmRNA的表達(dá)水平高于對照組(P＜0.05)。 4.在24孔板上，成脂誘導(dǎo)組和祛脂素實驗組光鏡下每高倍鏡下各計數(shù)100個細(xì)胞。誘導(dǎo)組脂肪細(xì)

8、胞出現(xiàn)脂肪滴細(xì)胞的平均陽性率為83.21﹪±0.2﹪，而祛脂素實驗組的平均陽性率則為12.8﹪±0.4﹪。實驗組與誘導(dǎo)組比較脂肪細(xì)胞陽性率明顯較少(P＜0.01)。實驗組細(xì)胞的PPARγ蛋白水平和PPARγmRNA表達(dá)水平與誘導(dǎo)組比較，均有明顯差異(P＜0.01)。 5.祛脂素對AA骨髓的去脂化作用：AA對照組細(xì)胞中脂肪滴陽性率為87.3﹪±0.6﹪，祛脂素實驗組細(xì)胞中脂肪滴陽性率為12.6﹪±0.3﹪。兩組配對t檢驗比較有顯著

9、性差異(P＜0.01)。實驗組PPARγ蛋白表達(dá)水平和PPARγmRNA表達(dá)水平均比對照組明顯降低，和對照組比較均有明顯差異(P＜0.01)。 結(jié)論：1.進(jìn)一步驗證骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以向脂肪細(xì)胞方向分化，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向本胚層縱向分化的潛能。 2.祛脂素對骨髓MSC誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞的過程具有抑制作用，能降低使脂肪細(xì)胞中的PPARγ蛋白和PPARγmRNA表達(dá)水平。 3.祛脂素能抑制AA患者骨髓MSC向