免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少癥患者骨髓造血細(xì)胞膜靶抗原的研究.pdf

1、目的:
　　 1.檢測(cè)免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少癥(immuno-related pancytopenia，IRP)患者自身抗體IgG在骨髓造血細(xì)胞膜上的作用靶點(diǎn)，探索IRP患者造血細(xì)胞膜上可能的靶抗原成分，為進(jìn)一步純化和克隆IRP患者自身抗原提供依據(jù)。2.檢測(cè)已發(fā)現(xiàn)的紅系膜抗原促紅細(xì)胞生成素受體(erythropoietin receptor，EPOR)在樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)上的表達(dá)，以期初步驗(yàn)證IRP

2、中抗原呈遞的過(guò)程。
　　 方法:
　　 1.研究對(duì)象為32例初治IRP患者作為實(shí)驗(yàn)組，15例再生障礙性貧血(AA)患者作為病例對(duì)照組及15名正常健康者作為對(duì)照。FCM檢測(cè)骨髓造血細(xì)胞膜抗體，提取細(xì)胞膜蛋白，同時(shí)使用辛酸法+鹽析法提純骨髓上清液中的IgG，然后使用免疫印跡法檢測(cè)IRP患者骨髓上清液中自身抗體IgG的陽(yáng)性率，進(jìn)而應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合免疫印跡法分離和鑒定IRP患者自身抗體IgG在細(xì)胞膜上的靶抗原，并與正常

3、對(duì)照及病例對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比;選取目標(biāo)蛋白條帶進(jìn)行高壓液相串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析以確定靶抗原成分。并對(duì)所鑒定出的部分蛋白成分檢測(cè)其在造血細(xì)胞膜上的異常表達(dá)。
　　 2.研究對(duì)象為39例骨髓有核紅細(xì)胞抗體陽(yáng)性(GlycoA+)患者、30例GlycoA-患者、及17名正常健康者作為對(duì)照。使用FCM檢測(cè)骨髓DC細(xì)胞胞膜及胞漿中EPOR的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)一步使用RT-PCR的方法檢測(cè)不同組病例骨髓除紅系后造血細(xì)胞中EPO

4、R的mRNA表達(dá)的差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.IRP患者組骨髓上清液中IgG的陽(yáng)性率為50％(16/32)，明顯高于病例對(duì)照組(0％)和正常對(duì)照組(13％，2/15)（均P＜0.01）。在32例初治IRP患者中，其骨髓造血細(xì)胞膜上共有兩種蛋白成分可被自身抗體IgG識(shí)別，其相對(duì)分子量分別為72-95kDa及55kDa，陽(yáng)性率分別為56.25％(9/16)和31.25％(5/16)。切割蛋白條帶進(jìn)行高壓液相串聯(lián)質(zhì)譜分析，

5、發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白和WD重復(fù)序列蛋白兩種膜蛋白成分，其中乳鐵蛋白第121位精氨酸存在替代點(diǎn)突變，被絲氨酸或天門(mén)冬氨酸所取代。正常對(duì)照組10-25kDa蛋白條帶未鑒定成功。進(jìn)一步檢測(cè)乳鐵蛋白在有核紅細(xì)胞膜上的表達(dá)。GlycoA+組患者骨髓有核紅細(xì)胞乳鐵蛋白的平均陽(yáng)性率為13.44±3.53％，明顯高于GlycoA-組患者的3.22±2.32％(P＜0.001)及正常對(duì)照組的0.54±0.48％(P＜0.001)，后兩者之間亦存在明顯差異(P＜0

6、.05)。
　　 2.EPOR在骨髓DC細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 a) GlycoA+組與GlycoA-進(jìn)行比較。
　　 i.DC1細(xì)胞膜上EPOR的表達(dá)，GlycoA+組表達(dá)率1.45±5.45％與GlycoA-組表達(dá)率9.89±4.03％及正常對(duì)照組表達(dá)率1.06±2.06％無(wú)明顯差異，而后兩者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.016)。DC1胞漿中EPOR的表達(dá)，GlycoA+組表達(dá)率24.67±31.15％，明顯高

7、于GlycoA-組表達(dá)率8.45±3.04％(P＜0.05)及正常對(duì)照組表達(dá)率12.45±28.46％(P=0.001)，后兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 ii.DC2細(xì)胞膜上EPOR的表達(dá)，GlycoA+組表達(dá)率10.47±5.26％，明顯高于正常對(duì)照組表達(dá)率0.94±2.67％(P＜0.05)，與GlycoA-組表達(dá)率13.23±7.27％無(wú)明顯差異。DC2胞漿中EPOR的表達(dá)，GlycoA+組表達(dá)率30.85±11.20％，

8、明顯高于GlycoA-組表達(dá)率15.44±6.53％(P＜0.05)及正常對(duì)照組表達(dá)率10.34±4.88％(P=0.001)，后兩者之間亦有明顯差異差異(P＜0.05)。
　　 b)使用上述數(shù)據(jù)對(duì)兩實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行組內(nèi)DC1與DC2的比較、
　　 i.GlycoA+組，DC1與DC2胞膜EOPR表達(dá)率均明顯低于胞內(nèi)(P均＜0.05)。DC2細(xì)胞EPOR表達(dá)率無(wú)論在細(xì)胞膜上還是在胞漿中均明顯高于DC1細(xì)胞的表達(dá)(P＜0.05)

9、。
　　 ii.GlycoA組DC1與DC2的EPOR胞膜胞漿上的表達(dá)均無(wú)明顯差異。
　　 c)骨髓去除紅系后細(xì)胞，三組EOPR的mRNA均未見(jiàn)表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.IRP患者骨髓上清液中存在自身抗體IgG，可作用于骨髓細(xì)胞膜上多個(gè)靶抗原成分，乳鐵蛋白及WD重復(fù)序列蛋白就是其中兩種可能的抗原，且部分乳鐵蛋白存在第121為精氨酸序列的替代點(diǎn)突變，被絲氨酸或天門(mén)冬氨酸所替代。另外IRP患者的有核紅細(xì)