磁性納米顆粒連接miR-155分子信標(biāo)用于非小細(xì)胞肺癌診斷的實驗研究.pdf

1、背景與目的：肺癌是所有惡性腫瘤中導(dǎo)致死亡的最主要原因，其總5年生存率僅為15％左右，肺癌中NSCLC占80%左右。缺乏有效的早期診斷手段是影響其預(yù)后和生存率的重要原因。如何從肺癌的始動環(huán)節(jié)探討其早診方法，是本課題組近年一直思考的問題。腫瘤干細(xì)胞或腫瘤啟動細(xì)胞具有很強的自我更新能力和多向分化潛能，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、腫瘤治療抵抗、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要因素，不但是潛在治療靶標(biāo)，還可為腫瘤的早期診斷帶來新的線索。微小RNA(miRNA)在腫瘤的發(fā)生

2、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，檢測NSCLC干細(xì)胞相關(guān)的miRNAs可能是肺癌早期診斷的一個重要策略。分子信標(biāo)是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理設(shè)計的一種高靈敏性和高特異性檢測工具，可被用來進行核酸-核酸和活細(xì)胞內(nèi)可視化研究，為腫瘤診斷和活體成像研究提供技術(shù)支持；而磁性納米顆粒則是一種可應(yīng)用于細(xì)胞和整體水平的較為理想的分子信標(biāo)載體，PLGA包覆的磁性納米顆粒具有良好的生物學(xué)相容性和低毒性，PEG等修飾后的磁性納米顆粒有很好的長循環(huán)穩(wěn)定性。本研究擬以N

3、SCLC為疾病模型，分選NSCLC干細(xì)胞，通過體內(nèi)和體外實驗，應(yīng)用分子信標(biāo)和納米技術(shù)，檢測活體內(nèi)NSCLC發(fā)生相關(guān)的miRNA的表達，探討肺癌早期診斷的新途徑。
　　 方法：應(yīng)用免疫磁珠分選方法從A549細(xì)胞中分選富集CD133+CD338+NSCLC干細(xì)胞，并對其進行鑒定，檢測相關(guān)mRNA的表達。設(shè)計合成miR-155分子信標(biāo)和隨機序列分子信標(biāo)，通過液相雜交實驗驗證其特異性，以PC-3前列腺癌細(xì)胞作陽性對照，通過激光共聚焦檢測

4、NSCLC活細(xì)胞miR-155的表達，并用實時熒光定量PCR進行驗證；建立裸鼠肺癌移植瘤模型，局部注射miR-155分子信標(biāo)，通過活體成像系統(tǒng)檢測局部移植瘤內(nèi)miR-155的表達。應(yīng)用吸附法制備分子信標(biāo)磁性納米復(fù)合物，激光共聚焦顯微鏡檢測分子信標(biāo)磁性納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染后NSCLC細(xì)胞miR-155的表達。通過活體成像系統(tǒng)檢測局部和尾靜脈注射分子信標(biāo)磁性納米復(fù)合物后移植瘤內(nèi)miR-155的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過免

5、疫磁珠分選得到CD133+CD338+NSCLC干細(xì)胞，NSCLC干細(xì)胞增殖能力強于A549細(xì)胞，在NSCLC干細(xì)胞中表達CD133和CD338，肺癌干細(xì)胞相關(guān)基因(CD133、CD326、OCT-4、CD338、Nestin)表達較A549細(xì)胞相比高1倍以上，1×104CD133+CD338+NSCLC干細(xì)胞可成瘤。miR-155在NSCLC干細(xì)胞中表達較A549細(xì)胞高1.5倍左右。
　　 2.設(shè)計合成的分子信標(biāo)通過液相雜交實

6、驗顯示具有較高的特異性，A549細(xì)胞和SPC-A1細(xì)胞加入miR-155分子信標(biāo)后可見細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較強的綠色熒光，背景較低，加入隨機對照分子信標(biāo)后未見明顯熒光信號。定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-155表達與激光共聚焦結(jié)果一致。應(yīng)用活體成像系統(tǒng)檢測移植瘤內(nèi)注射miR-155分子信標(biāo)后可見較強的綠色熒光信號，注射隨機對照分子信標(biāo)后未見明顯熒光信號。
　　 3.透射電鏡觀察合成的分子信標(biāo)磁性納米復(fù)合物大小較均勻，磁性納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染后通

7、過激光共聚焦顯微鏡檢測到分子信標(biāo)NSCLC細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光信號miR-155的表達。通過活體成像系統(tǒng)檢測局部注射分子信標(biāo)磁性納米復(fù)合物后移植瘤內(nèi)miR-155的表達，經(jīng)尾靜脈注射后也可檢測到肺癌原位瘤內(nèi)miR-155的表達。
　　 結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用免疫磁珠分選成功得到CD133+CD338+NSCLC干細(xì)胞。經(jīng)相關(guān)實驗驗證CD133+CD338+NSCLC干細(xì)胞具有肺癌干細(xì)胞的干性；熒光定量PCR檢測到CD133+