殼聚糖納米包裹miR-155分子信標(biāo)實時成像肺癌細胞的實驗研究.pdf

1、背景與目的： 肺癌是最常見的惡性腫瘤，其總的5年生存率不足15％，嚴(yán)重威脅人類健康。有效的早期診斷方法是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵，基于腫瘤干細胞(cancerstemcell，CSC)理論的新策略有望為肺癌早診帶來突破。CD133是經(jīng)典的CSCs標(biāo)記物，成功用于包括腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌以及胰腺癌的CSCs的鑒定與分離。最近，EramoA等證實CD133是肺癌干細胞(lungcancerstemcells，LCSCs)新的

2、標(biāo)記物，為研究以LCSCs為靶標(biāo)的肺癌早期診斷策略提供了契機。此外，已有不少的研究表明：特異的微小RNA(miRNA)在維持肺上皮干細胞(lungepitheliumstemcells,LSCs)生物學(xué)特性、促進肺癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用，是潛在的肺癌早期診斷的分子標(biāo)簽。基于此，我們設(shè)想：基于LCSCs和miRNAs雙靶標(biāo)的檢測手段可能是更理想的肺癌早期診斷策略。因此，本實驗擬經(jīng)Real-timePCR觀察miRNAs在CD133(

3、+)LCSCs中的表達水平差異，以期獲得CD133(+)LCSCs相關(guān)的miRNAs。 敏感的完整靶細胞內(nèi)特異性分子實時成像觀察是實現(xiàn)肺癌早期診斷的有效手段。分子信標(biāo)(molecularbeacon，MB)是根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET)原理設(shè)計的一種高靈敏性、高特異性檢測手段。較之于Real-timePCR、熒光原位雜交(fluorescenceinsi

4、tuhybridization，F(xiàn)ISH)等傳統(tǒng)的miRNAs檢測方法，分子信標(biāo)熒光技術(shù)可實現(xiàn)完整細胞內(nèi)特異性靶分子的實時成像觀察，是了解活細胞內(nèi)生物大分子相互作用的新的手段。目前，基于分子信標(biāo)技術(shù)的特異性miRNAs實時成像檢測的文獻報道較少。 類似于反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASO)，分子信標(biāo)活細胞內(nèi)應(yīng)用面臨生物穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)染效率低等諸多方面的困難。有研究提示用對DNA有保護作用的載體

5、并阻止分子信標(biāo)分子的核內(nèi)流是提高分子信標(biāo)穩(wěn)定性的有效的策略。在眾多的核酸載體中，殼聚糖納米顆粒(chitosannanoparticle，CS-NP)具有DNA保護作用、緩釋效應(yīng)等特性，可能是較為理想的分子信標(biāo)載體。然而，殼聚糖納米能否用作分子信標(biāo)技術(shù)的載體尚未見報道。 為此，本研究在分離、鑒定CD133(+)LCSCs并分析其miRNAs表達的基礎(chǔ)上，以CD133(+)LCSCs高表達的has-miR-155為研究對象，設(shè)計、

6、合成靶向結(jié)合成熟miR-155及其前體的特異性分子信標(biāo)(miR-155MB)。制備miR-155分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物實時成像觀察SPC-A1肺癌細胞內(nèi)miR-155的表達，為建立實時成像CD133(+)LCSCs特異性miRNAs表達的技術(shù)平臺奠定基礎(chǔ)。 實驗方法： 用CD133單抗觀察不同類型非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)組織中的CD133(+)LCSCs。用免疫磁珠分選

7、方法自NSCLC組織富集CD133(+)LCSCs。結(jié)合文獻，以肺癌相關(guān)miRNA(hsa-miR-155、hsa-miR-205a、hsa-miR-191、hsa-miR-21、hsa-miR-210、hsa-miR-17-5p和hsa-miR-106a)為檢測對象，經(jīng)Real-timePCR初步篩選CD133(+)LCSCs相關(guān)miRNA。 根據(jù)成熟has-miR-155序列設(shè)計、合成特異性miR-155分子信標(biāo)。同時，設(shè)計

8、、合成不能與任何內(nèi)源性序列互補結(jié)合的隨機序列MB(randomsequencemolecularbeacon，RSMB)作陰性對照。液相雜交實驗觀察miR-155分子信標(biāo)和隨機序列分子信標(biāo)的特異性和熱力學(xué)穩(wěn)定性。用miR-155分子信標(biāo)孵育丙酮固定的人NSCLC組織切片和H446、SPC-A1肺癌細胞觀察miR-155在肺癌內(nèi)的表達并經(jīng)Real-timePCR方法驗證。同時，用Vero細胞和PC-3前列腺癌細胞作對照。 吸附法制

9、備分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物。DNaseⅠ消化實驗、細胞蛋白提取物孵育實驗觀察分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物穩(wěn)定性。激光共聚焦觀察殼聚糖納米介導(dǎo)miR-155分子信標(biāo)轉(zhuǎn)染SPC-A1肺癌細胞及其檢測miR-155的表達能力。同時，用隨機序列分子信標(biāo)和Vero細胞作為陰性對照，評估活細胞內(nèi)熒光信號的特異性。 結(jié)果： 1、免疫熒光和流式分析發(fā)現(xiàn)12例不同類型的人NSCLC組織內(nèi)存在比例約為0.11～1.2％的CD133(+)LCSC

10、s，而正常肺組織未見CD133(+)細胞。免疫磁珠分選、富集CD133(+)LCSCs并經(jīng)Real-timePCR檢測發(fā)現(xiàn)hsa-miR-17-5p、hsa-miR-155在富集的AC133(+)LCSCs中高表達，較之于AC133(-)肺癌細胞，表達上調(diào)分別為1.44、1.13倍。 2、液相雜交實驗顯示分子信標(biāo)有很好的特異性和熱動力學(xué)穩(wěn)定性。miR-155分子信標(biāo)孵育固定的NSCLC組織切片和H446、SPC-A1肺癌細胞后發(fā)

11、現(xiàn)肺癌細胞胞漿內(nèi)可見特異的紅色熒光，而背景很低，陰性對照組未見到明顯熒光信號。Real-timePCR結(jié)果證明熒光信號來源于miR-155分子信標(biāo)與靶分子特異性結(jié)合。 3、經(jīng)吸附法制備分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物。瓊脂糖凝膠電泳和熒光屏蔽實驗顯示當(dāng)Wcs-Np/WODN≥5:1時復(fù)合物結(jié)合較為完全，粒徑和Zeta電位分析顯示分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物適合于細胞轉(zhuǎn)染。DNaseⅠ保護實驗表明分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物有抗核酸酶降解作用。胞

12、漿蛋白孵育2h后裸分子信標(biāo)熒光強度增加約2～3倍，而核蛋白孵育裸分子信標(biāo)后熒光強度增加約9倍，表明胞核蛋白對裸分子信標(biāo)構(gòu)象穩(wěn)定性影響明顯。用胞核蛋白孵育分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物2h后發(fā)現(xiàn)分子信標(biāo)熒光信號無明顯增強，提示殼聚糖納米能有效阻止分子信標(biāo)與蛋白的非特異性結(jié)合。繼續(xù)孵育24h后熒光信號增強約5～6倍，顯示分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物的緩釋效應(yīng)。進一步用殼聚糖納米作為載體介導(dǎo)miR-155分子信標(biāo)轉(zhuǎn)染SPC-A1肺癌細胞24h后發(fā)現(xiàn)：大

13、約40～50％的SPC-A1細胞內(nèi)可見較強的紅色熒光，以胞漿內(nèi)較為明顯，顯示轉(zhuǎn)染效率較高，且SPC-A1細胞漿內(nèi)的熒光信號主要來源于miR-155分子信標(biāo)與其靶分子的特異性結(jié)合。核內(nèi)可見弱的熒光信號表明殼聚糖納米可阻止分子信標(biāo)迅速、大量在核內(nèi)聚集，用殼聚糖納米作為載體是減少分子信標(biāo)核內(nèi)非特異性信號的有效策略。 4、實時成像SPC-A1肺癌細胞移植瘤的實驗研究正在進行中。 結(jié)論： 1、不同類型人NSCLC組織內(nèi)存在

14、極低比例的CD133(+)LCSCs。免疫磁珠分選富集CD133(+)LCSCs并經(jīng)Real-timePCR初步檢測發(fā)現(xiàn)hsa-miR-17-5p、hsa-miR-155在富集的CD133(+)LCSCs中有較顯著的過表達。 2、成功設(shè)計、合成特異性miR-155分子信標(biāo)并應(yīng)用于固定的肺癌細胞內(nèi)miR-155基因表達的檢測。 3、成功用殼聚糖納米包裹分子信標(biāo)并實時成像SPC-A1肺癌細內(nèi)miR-155基因的表達，為建立實