抗DNA抗體蛋白涂層支架攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染小型豬冠狀動脈的可行性研究.pdf

1、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)及支架置入術(shù)作為冠心病血管重建的有效方法之一，已在世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用，而術(shù)后再狹窄成為困擾其發(fā)展的一個(gè)主要問題。 近年來，藥物洗脫支架(DES)在降低再狹窄率方面取得了顯著進(jìn)展，但DES也不能完全消除再狹窄，且其存在的晚發(fā)血栓也成為一個(gè)新的問題，盡管發(fā)生率很低，但可造成嚴(yán)重的后果甚至猝死。 基因治療仍然可能成為有效解決再狹窄問題的途徑之一。基因治療再狹窄涉及三個(gè)方面的問題：篩選有效

2、的治療基因；構(gòu)建安全、高效的轉(zhuǎn)染載體；選擇安全、精確的機(jī)械運(yùn)載系統(tǒng)。目前，所有國內(nèi)外的研究結(jié)果都未能達(dá)到臨床應(yīng)用的階段。 本課題組在基因治療再狹窄領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究已歷時(shí)近十年。已建立以膠原蛋白涂層支架作為機(jī)械運(yùn)載平臺的系統(tǒng)，并初步篩選了人誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因作為治療性基因片段。 在基因載體方面，本課題組先后采用腺病毒載體和質(zhì)粒載體，均在小型豬動物模型中成功實(shí)現(xiàn)iNOS基因的轉(zhuǎn)染。然而，腺病毒載體存在安全性隱患

3、，而質(zhì)粒載體則轉(zhuǎn)染效率較低。究其原因，主要是由于蛋白涂層對質(zhì)粒載體的吸附力不足，導(dǎo)致局部治療基因有效濃度不能維持較高水平所致。 為解決這個(gè)問題，本課題組與天津生物工程研究所合作利用抗DNA抗體與質(zhì)粒的抗原抗體反應(yīng)提高蛋白涂層支架對質(zhì)粒載體的吸附力，使iNOS基因的轉(zhuǎn)染效率提高，從而提高其防治再狹窄的治療效果。 本課題是該系列研究的第一階段，主要探索抗DNA抗體蛋白涂層支架攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染小型豬冠狀動脈的可

4、行性。 實(shí)驗(yàn)利用SPDP的雙官能團(tuán)特性，以其為偶聯(lián)劑以共價(jià)鍵連接抗DNA抗體與支架的膠原蛋白涂層，再利用抗DNA抗體與質(zhì)粒DNA的相互作用實(shí)現(xiàn)將質(zhì)粒固定于蛋白涂層支架上的目的。攜帶質(zhì)粒的抗DNA抗體蛋白涂層支架制備完成后，以常規(guī)支架置入技術(shù)置入小型豬冠狀動脈內(nèi)7日，以實(shí)驗(yàn)其轉(zhuǎn)染能力。 本實(shí)驗(yàn)共分兩部分。第一部分選用pEGFP-C1質(zhì)粒(攜帶綠色螢光蛋白基因)。支架置入術(shù)后7日，收集支架段血管和支架下游血管，冰凍切片后于熒

5、光顯微鏡下觀察。結(jié)果表明大量綠色熒光顆粒散布于支架段冠狀動脈內(nèi)彈力板旁和血管壁中層內(nèi)側(cè)1/2，說明抗DNA抗體蛋白涂層支架可以攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染小型豬冠狀動脈，且其轉(zhuǎn)染深度可達(dá)血管壁中層內(nèi)側(cè)1/2。 第二部分選用pcDNA3.1-iNOS質(zhì)粒(攜帶一氧化氮合酶基因)。支架置入術(shù)后7日，收集支架段血管以及支架段下游1cm處血管、支架段血管周圍心肌、肺、肝和腎組織，送RT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明支架段血管壁內(nèi)有一氧化氮合酶基因表達(dá)，