利用VIGS技術(shù)在番茄中驗證與萜類等代謝調(diào)控相關(guān)的柑橘同源基因.pdf

1、番茄果皮和果肉中能夠積累萜類和類黃酮物質(zhì)，是初生和次生代謝相關(guān)基因功能研究的良好模式材料。目前，人們對能同時調(diào)控番茄類胡蘿卜素和類黃酮等代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子知之甚少。病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)不需要遺傳轉(zhuǎn)化操作，可高效、快速地顯著降低擬沉默基因的表達(dá)量，是研究轉(zhuǎn)錄因子功能的重要技術(shù)手段。本研究以Micro-Tom番茄為材料，以TRV-PDS為陽性對照，利用VIGS、qRT-PCR及HPLC、GC-MS、LC-MS等分析檢測技術(shù)對7

2、個柑橘同源基因進(jìn)行篩選，結(jié)果表明:
　　利用雙酶切技術(shù)，已成功構(gòu)建TRV-DS陽性對照及7個柑橘同源基因的沉默載體;通過葉片滲透、果柄注射兩種方法侵染番茄植株，數(shù)天后，在新長出的葉片及果實(shí)中通過PCR擴(kuò)增均能檢測到TRV1/TRV2病毒存在;TRV-PDS沉默植株新長出葉片出現(xiàn)明顯的光漂白現(xiàn)象，各沉默株系轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的均顯著性下降，說明TRV有效復(fù)制、轉(zhuǎn)移，起到了良好的沉默效果。
　　沉默植株葉片類胡蘿卜素總量均顯著下降。

3、其中，TRV-ABA處理的沉默植株效果最為突出，紫黃質(zhì)下降了2.90倍，達(dá)0.57±0.06mg/g(DW);葉黃素下降了2.25倍，達(dá)3.85±0.22mg/g(DW)，β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、番茄紅素也分別下降了2.14、3.80、2.59倍;TRV-RAP和TRV-AGL沉默植株中玉米黃質(zhì)和番茄紅素也均發(fā)生顯著性下降，有近6倍和3倍的差異。
　　沉默植株果實(shí)類胡蘿卜素總量均上升。其中，TRV-ACO沉默植株果實(shí)中β-胡蘿卜素

4、發(fā)生顯著性下降，達(dá)21.64±1.18μg/g(FW); TRV-RAP中番茄紅素和γ-胡蘿卜素與對照相比分別上升了1.90和2.53倍;TRV-ARG、TRV-DET、 TRV-ABA、TRV-GA沉默植株中γ-胡蘿卜素也顯著提高，與對照相比均提高了2倍以上。
　　利用LC-MS共檢測到葉片中氨基酸6種，酚酸及類黃酮物質(zhì)26種，其中含量最高的是α-番茄堿，達(dá)到13.54±2.91μg/g(DW)。利用MPP軟件分析后發(fā)現(xiàn)沉默植株

5、葉片中類黃酮與對照相比組成和含量上沒有顯著變化。
　　果實(shí)中檢測到11種氨基酸，43種酚酸及類黃酮物質(zhì)，比葉片中物質(zhì)種類豐富。其中果實(shí)中含量最高的是香豆酸，達(dá)到22.26±1.77μg/g(DW)。利用MPP軟件分析后發(fā)現(xiàn)沉默植株果實(shí)中類黃酮與對照相比均有物質(zhì)呈倍性增減，如山奈酚3-O蕓香糖苷、蘆丁、α-番茄堿、咖啡酰丁二胺等。
　　利用GC-MS技術(shù)共檢測到番茄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)38種，其中烯醛類占主要部分，含量最高的是經(jīng)TR