利用VIGS技術(shù)進行油菜抗病相關(guān)WRKY70和LRR-RLK基因的功能驗證.pdf

1、WRKY70和LRR-RLK在許多植物中都參與了植物的抗病反應(yīng)， WRKY70是植物信號傳導(dǎo)過程中的重要成員，在植物抗病過程中發(fā)揮著重要作用，主要參與了茉莉酸(JA)與水楊酸(SA)途徑，LRR-RLK可以直接或間接的識別病原物，并將信號傳遞下去，使植物產(chǎn)生一系列抗病反應(yīng)。本研究在利用黑脛病菌侵染油菜的轉(zhuǎn)錄組測序基礎(chǔ)上，篩選高表達及差異表達基因，結(jié)合油菜全基因組測序數(shù)據(jù)，獲得WRKY70和LRR-RLK兩個基因全長，為了深入了解這兩個基

2、因的信息及驗證其在油菜中的抗病功能，為鑒定油菜抗病通路中重要基因的功能提供數(shù)據(jù)信息，利用生物信息學進行了序列分析，然后采用VIGS技術(shù)，將攜帶外源基因的cDNA導(dǎo)入宿主，誘發(fā)宿主同源基因沉默，來達到驗證基因功能的目的。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴根據(jù)前期用弱侵染型菌株NM-1侵染油菜得到的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中WRKY70和LRR-RLK基因的全長CDS序列，利用CLC SequenceViewer6推導(dǎo)WRKY70和LRR-RLK氨基

3、酸序列，并對WRKY70和LRR-RLK氨基酸序列進行蛋白大小、等電點、結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、N-糖基化位點以及疏水性分析。其中WRKY70基因CDS全長858bp，編碼285個氨基酸，含有一個WRKY保守結(jié)構(gòu)域，屬于Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子;LRR-RLK基因CDS全長2775bp，編碼924個氨基酸，含有絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性位點。⑵克隆WRKY70和LRR-RLK基因部分CDS序列，WRKY70片段大小為308bp，LRR-RLK基因

4、片段大小為394bp，測序后進行序列比對，與轉(zhuǎn)錄組序列100％一致。⑶將成功構(gòu)建的VIGS沉默載體pTRV2-WRKY70和pTRV2-LRR-RLK，轉(zhuǎn)入大腸桿菌MC1061中進行菌液PCR及單、雙酶切驗證后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，用于侵染油菜葉片。⑷農(nóng)桿菌介導(dǎo)的沉默載體侵染油菜葉片14d后接種黑脛病病原菌NM-1，收集4h、12h、24h、36h、48h、96h葉片，提取RNA通過qPCR檢測目的基因表達量，并觀察植株發(fā)病