食管癌細(xì)胞死亡受體5的表達(dá)與細(xì)胞周期的相關(guān)性分析.pdf

1、研究背景：
　　死亡受體5(Deathreceptor5，DR5)是腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)的主要死亡受體之一，在TRAIL促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是具有抗腫瘤應(yīng)用前景的潛在的重要靶點(diǎn)之一。目前已有3種針對(duì)死亡受體5的靶向性抗腫瘤藥物正處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)之中。然而細(xì)胞表面的DR5表達(dá)量是影響及限制死亡受體5的靶向性抗腫瘤藥物作用的一個(gè)重要因素。由于DR5只有在細(xì)胞表面才能發(fā)揮作用，因此凡是促進(jìn)細(xì)胞表面DR5表

2、達(dá)增加的因素均能提高細(xì)胞對(duì)TRAIL及抗DR5激動(dòng)性抗體等藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性。目前，眾多研究表明以DR5為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物與眾多化療藥物具有顯著的協(xié)同抗腫瘤作用，并降低了化療藥物的使用劑量及其應(yīng)用所帶來(lái)的毒副作用。進(jìn)一步探討表明這些化療藥物多數(shù)能夠影響細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖，能有效增強(qiáng)細(xì)胞表達(dá)DR5。但是這些藥物是否通過(guò)細(xì)胞周期影響DR5表達(dá)，兩者之間即細(xì)胞周期與DR5表達(dá)是否具有密切聯(lián)系還不清楚。本課題的研究將明確細(xì)胞周期與DR5

3、表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，這一研究結(jié)果將對(duì)抗腫瘤治療及以DR5為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物應(yīng)用提供臨床指導(dǎo)，以及為闡明細(xì)胞周期影響DR5表達(dá)的分子機(jī)制提供理論指導(dǎo)，具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)本課題也純化出可溶性sDR5，并通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備出DR5單克隆抗體，探索了關(guān)于DR5單克隆制備的技術(shù)條件。
　　目的:探究腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期與DR5表達(dá)的相關(guān)性以及檢測(cè)DR5的表達(dá)和分布，并探索純化可溶性DR5蛋白(sDR5)和制備sDR5單克隆抗體的方法

4、，同時(shí)探索了所制備抗體的特異性。
　　方法:采用柱親和層析法純化sDR5;雜交瘤技術(shù)制備sDR5單克隆抗體;分子克隆技術(shù)轉(zhuǎn)染外源基因，用過(guò)量的Thymidin處理EC109，進(jìn)行雙阻斷同步化法得到不同周期時(shí)相的細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各個(gè)周期的DR5表達(dá)。免疫組化法、Westernblot免疫印跡法、免疫熒光法，流式細(xì)胞術(shù)，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各個(gè)周期DR5的表達(dá)和定位。采用攜帶目的基因DR5的pegfp-n2重組載體轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞

5、EC109中，觀察細(xì)胞處于鋪展或者非粘附狀態(tài)下的DR5表達(dá)分布和定位情況。
　　結(jié)果:純化出純度達(dá)到95％的sDR5蛋白;制備出活性良好的sDR5單克隆抗體;成功構(gòu)建穩(wěn)定的帶有DR5的pegfp-n2的細(xì)胞株;細(xì)胞免疫組化和轉(zhuǎn)染重組載體pegfp-n2+DR5外源基因至EC109細(xì)胞中觀測(cè)DR5的表達(dá)，在鋪展?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞中，DR5主要分布在胞質(zhì)和胞核周圍;而在非粘附狀態(tài)下，DR5主要分布在胞膜周圍，且DR5在胞質(zhì)中呈聚集狀態(tài)。Thy

6、midin雙阻斷同步化釋放法，處理EC109細(xì)胞，分別在0h、3.5h、7.5h這三個(gè)不同時(shí)段獲得G1(90.04％)、S期(97.86％)、G2期(87.17％)這三個(gè)不同細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞;根據(jù)以上方法所獲得不同周期細(xì)胞來(lái)檢測(cè)DR5的表達(dá)結(jié)果:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EC109細(xì)胞不同細(xì)胞周期時(shí)相的DR5表達(dá)水平:normal組表達(dá)率為99.44％;G1期表達(dá)量為93.80％;S期的表達(dá)量為98.66％;G2期表達(dá)量為99.58％;免疫組化檢

7、測(cè)EC109細(xì)胞不同細(xì)胞周期時(shí)相的DR5表達(dá)（如圖13），DR5在不同細(xì)胞周期時(shí)相的表達(dá)量G0/G1期＜S期＜G2/M期;westernblot檢測(cè)不同細(xì)胞周期時(shí)相的DR5表達(dá)結(jié)果（如圖14），G1期低于S期，低于G2期，G2期表達(dá)最高;Realtime-PCR檢測(cè)在不同細(xì)胞周期時(shí)相的DR5表達(dá)量（如圖16），G0/G1和S期的DR5表達(dá)與G2/M期相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有表達(dá)差異;我們采用2.5mMThymidine雙阻斷同步化法處理EC

8、109細(xì)胞，獲得G0/G1期細(xì)胞;采用10uMLJK-11和20nM秋水仙素處理EC109細(xì)胞24h，獲得G2/M期細(xì)胞，用一定濃度的具有促凋亡活性的抗DR5的抗體mDRA-6（本實(shí)驗(yàn)室前期制備）分別處理正常EC109細(xì)胞、G0/G1期細(xì)胞、G2/M期細(xì)胞，AnnexinV和PI染色處理，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡（如圖17），G0/G1期與G2/M期相比，差異顯著，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:1、得到一株特異性良好以及活