RNA干擾53BP1和MDC1對體內(nèi)外食管癌細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、目的：探討RNA干擾細(xì)胞周期檢測點激酶53BP1、MDC1對體內(nèi)外食管鱗癌細(xì)胞中p53、CHK1、CHK2、CHK2-T68蛋白表達的影響。 方法：首先利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建未轉(zhuǎn)染、空載體轉(zhuǎn)染、MDC1轉(zhuǎn)染、53BP1轉(zhuǎn)染四種食管癌Eca109細(xì)胞株。分別接種四種細(xì)胞至六孔板內(nèi)，制備細(xì)胞爬片，接受5Gyγ射線照射后0h、0.5h、1h、2h、4h和12h收集細(xì)胞。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測四種細(xì)胞株在各時間點CHK2-T68蛋白的

2、表達情況，均設(shè)6個平行組。其次，培養(yǎng)四種細(xì)胞至最佳致瘤細(xì)胞數(shù)，建立裸鼠人食管鱗癌模型，分為未照射組：未轉(zhuǎn)染組(A組)、空載體轉(zhuǎn)染組(B組)、53BP1轉(zhuǎn)染組(C組)、MDC1轉(zhuǎn)染組(D組)；照射組：未轉(zhuǎn)染+照射組(E組)、空載體轉(zhuǎn)染+照射組(F組)、53BP1轉(zhuǎn)染+照射組(G組)、MDC1轉(zhuǎn)染+照射組(H組)，每組6只裸鼠。照射后1h處死裸鼠，剝離腫瘤，應(yīng)用免疫組化S-P法檢測各組標(biāo)本中p53、CHK1、CHK2蛋白的表達。利用SPSS

3、 for Windows 13.0統(tǒng)計分析軟件包中重復(fù)測量的方差分析和單因素方差分析對結(jié)果進行處理分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，當(dāng)：P＜0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 體外實驗：未轉(zhuǎn)染組在照射后0h、0.5h、1h、2h、4h和12h時CHK2-T68蛋白的陽性表達細(xì)胞數(shù)(/200個)分別為7±3.08、72±9.54、90±11.31、79±12.08、55±11.27和6±

4、2.64：空載體轉(zhuǎn)染組在各時間點CHK2-T68蛋白的陽性表達細(xì)胞數(shù)(/200個)分別為8±3.31、72±10.17、89±14.40、76±11.76、53±8.69、6±2.04；兩者均在照射后1h內(nèi)表達增多，之后逐漸下降，至照射后12h降至照射前水平?？蛰d體轉(zhuǎn)染組的變化趨勢與未轉(zhuǎn)染組相同(P＞0.05)。MDC1轉(zhuǎn)染組在各時間點CHK2-T68蛋白的陽性表達細(xì)胞數(shù)(/200個)分別為6±2.16、55±8.91、72±10.78

5、、61±9.54、42+6.63、5+1.75：MDCl轉(zhuǎn)染后CHK2-T68蛋白的表達峰值稍有下降(P＜0.05)，但變化趨勢同未轉(zhuǎn)染組。53BP1轉(zhuǎn)染組CHK2-T68蛋白在各時間點的陽性表達細(xì)胞數(shù)(/200個)分別為6±2.17、40±9.30、49±10.37、41±10.80、29+11.20、6±2.16；與未轉(zhuǎn)染組比較峰值明顯降低(P＜0.05)，53BP1轉(zhuǎn)染后CHK2-T68蛋白的表達峰值低于MDC1轉(zhuǎn)染組(P＜0.0

6、5)，但變化趨勢相同。 體內(nèi)實驗：(1)p53蛋白在未轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、MDC1轉(zhuǎn)染組、53BP1轉(zhuǎn)染組食管鱗癌組織中的陽性表達細(xì)胞數(shù)(/200個)分別為：54±13.43、57±14.47、25±14.61、48±17.22，各組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)。抑制53BPl蛋白表達可以降低P53蛋白表達(P=0.01)。CHK1蛋白在A、B、C、D組食管鱗癌組織中的陽性表達細(xì)胞數(shù)(/200個)分別為：54±13.25、5

7、0±14.67、78±19.39、59±16.11，各組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03)。抑制53BP1蛋白表達增加CHK1蛋白表達(P=0.04)。CHK2蛋白在A、B、C、D組食管鱗癌組織中的陽性表達細(xì)胞數(shù)(/200個)分別為：62±14.56、57±14.08、82±11.72、55±13.44，各組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)。抑制53BP1蛋白表達增加CHK2蛋白表達(P=0.04)。(2)p53蛋白在E、F、G、H組食管鱗癌

8、組織中的陽性表達細(xì)胞數(shù)(/200個)分別為：94±15.25、88±25.05、60±16.18、81±20.57，各組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.04)。與單純照射組相比，53BP1轉(zhuǎn)染+照射組P53蛋白的表達降低(P=0.02)℃HK1蛋白在E、F、G、H組食管鱗癌組織中的陽性表達細(xì)胞數(shù)(/200個)分別為：35±14.32、30±12.52、56±12.33、38±13.85，各組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)。與單純照射組相比，53

9、BP1轉(zhuǎn)染+照射組CHK1蛋白的表達升高(P=0.03)℃HK2蛋白在E、F、G、H組食管鱗癌組織中的陽性表達細(xì)胞數(shù)(/200個)分別為：41±13.30、34±14.66、63±15.67、36±12.09，各組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)。與單純照射組相比，53BP1轉(zhuǎn)染+照射組CHK2蛋白的表達升高(P=0.04)。結(jié)論： (1)抑制MDC1或53BP1蛋白表達使體外食管癌細(xì)胞照射后CHK2-T68磷酸化水平降低；(2)抑制53