大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引發(fā)Balb-c小鼠過敏反應及其機理的研究.pdf

1、食物過敏被視為一種嚴重的公共營養(yǎng)衛(wèi)生問題，引起了全球廣泛的關注。大豆是人類和動物主要的蛋白質來源之一，但大豆同時也是聯(lián)合國規(guī)定的8類主要致過敏食物之一。近年來研究顯示，大豆中的致敏因子極大地影響了幼年動物對蛋白質的有效吸收，而且可以引起人和幼年動物發(fā)生過敏反應，因而限制了大豆及其制品在食品和飼料工業(yè)中的應用。
　　 本研究針對常見的大豆蛋白中的主要過敏成分：大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin，運用易致敏的Ba

2、lb/c小鼠作為試驗動物，在不使用免疫佐劑的條件下，通過連續(xù)5周的灌胃方式建立過敏試驗動物模型，系統(tǒng)研究glycinin和β-conglycinin誘導Balb/c速發(fā)型過敏反應的機理，并從粘膜免疫角度探討glycinin和β-conglycinin引發(fā)Balb/c小鼠粘膜變態(tài)反應的機理，從而為進一步研究glycinin和β-conglycinin的過敏機理以及預防大豆球蛋白過敏的發(fā)生提供科學依據(jù)。
　　 1.大豆球蛋白glyc

3、inin和β-conglycinin的提取、分離和純化
　　 從脫脂大豆中提取、分離和純化出大豆球蛋白glcyinin和β-conglycinin。采用免疫法提純大豆粗蛋白，利用硫酸銨沉淀進行分級鹽析除去大豆中的清蛋白，經Sephrose CL-6B層析進一步純化。結果顯示，經SDS-PAGE鑒定，glycinin和β-glycinin的純度達到95％以上。
　　 2.建立大豆球蛋白glycinin和β-conglyci

4、nin口服致敏Balb/c小鼠動物模型
　　 運用易致敏的Balb/c小鼠作為試驗動物，在不存在免疫佐劑的條件下，通過連續(xù)5周分別灌胃lmg/ml的glycinin和β-conglycinin建立過敏試驗動物模型。采用被動皮膚過敏試驗來測定小鼠血清中IgE和抗體反應；熒光測定法測定腸道組織胺的含量：光鏡檢測上皮細胞和肥大細胞的形態(tài)學。結果表明，大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin顯著增加了血清中IgE和IgG1

5、的抗體含量以及小腸組胺的含量。肥大細胞的完整率在灌胃28d時降到最低，glycinin組肥大細胞完整率較對照組降低了66％，β-conglycinin組較對照組降低了65.7％；同時肥大細胞脫顆粒現(xiàn)象嚴重，腸道上皮細胞損壞嚴重，且血壓在灌胃大豆球蛋白后3h時達到最低點，與對照組相比，glycinin組小鼠血壓降低了17.6％，β-conglycinin組降低了20.8％。以上結果顯示，灌胃大豆球蛋白能夠誘導Balb/c小鼠的過敏反應，同

6、時表明Balb/c小鼠是檢測大豆球蛋白過敏性的一個合適的試驗動物。3.大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引發(fā)小鼠速發(fā)型過敏反應機理的研究
　　 在明確glycinin和β-conglycinin能夠引發(fā)Balb/e小鼠過敏反應的基礎上探討其誘導小鼠速發(fā)型過敏反應的免疫調節(jié)機理。分別用O、0.1mg/ml、lmg/ml和10mg/ml的大豆球蛋白灌胃Balb/c小鼠。ELISA法測定小鼠血清中IgE、IgG、I

7、gG1和IgG2a的抗體水平和脾臟細胞上清液中細胞因子的含量；MTT法測定脾臟淋巴細胞增殖情況；Annexin V-FITC法來檢測脾細胞凋亡；熒光定量RT-PCR法檢測脾臟胞中IL-4、IL-10和IFN-γ mRNA的表達量。結果表明，0.1mg/ml和lmg/ml的glcyinin與β-conglycinin組小鼠的抗體水平均顯著高于對照組（P<0.01），且在28d時各抗體水平均達到最高。與對照組相比，灌胃0.1mg/ml和Im

8、g/ml glycinin組和β-conglycinir組的小鼠脾細胞上清液均產生較高水平的IL-4、IL-5和IFN-γ(P<0.01)。灌胃lmg/ml的glycinin和β-conglycinin的小鼠脾細胞中細胞因子IL-4和IFN-γ mRNA表達量顯著增加，與對照組相比，glycinin和β-conglycinin組的IL-4mRNA分別提高了1.5倍和1.8倍，IFN-γ mRNA分別提高了1.5和1.7倍，同時IL-10

9、比對照組分別降低了0.6倍和0.7倍。研究表明，0.1mg/ml和lmg/ml的大豆球蛋白容易引發(fā)小鼠的速發(fā)型過敏反應，尤其是lmg/ml的大豆球蛋白引發(fā)的過敏反應更為嚴重。
　　 4.大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引發(fā)小鼠腸道粘膜變態(tài)反應機理的研究
　　 探討了大豆球蛋白造成小鼠口服耐受失敗而引發(fā)的過敏反應與腸道粘膜免疫之間的調控關系。免疫組化法測定小鼠小腸絨毛CD3+、CD4+和CD8+T淋巴

10、細胞的數(shù)量及固有層IgA+漿細胞的數(shù)量；TUNEL法測定小腸上皮細胞的凋亡率；熒光定量RT-PCR檢測小腸組織中IL-4、IFN-γ、IL-10和TGFβ1 mRNA的表達量；雙抗夾心法測定小腸液中slgA的含量。結果顯示，與對照組相比，灌胃glycinin的小鼠腸絨毛固有層淋巴細胞(LPL) CD3+和CD4+數(shù)量顯著高于對照組(P<0.01)，灌胃β-conglycinin的小鼠小腸CD3+和CD8+ LPL的數(shù)量（P<0.05）以

11、及CD4+LPL的數(shù)量（P<0.01）顯著高于對照組；同時固有層中整合素α4β7的數(shù)量均顯著高于對照組：灌胃glycinin的小鼠小腸上皮淋巴細胞(IEL)中CD3+、CD4+數(shù)量顯著高于對照組（P<0.05），整合素α4β7的數(shù)量也顯著高于對照組（P<0.01），灌胃β-conglycinin的小鼠小腸中CD3+、CD4+、CD8+IEL數(shù)量及整合素α4β7的數(shù)量顯著高于對照組(P<0.Ol)，CD4+/CD8+IEL比值也顯著高于對

12、照組(P<0.05)；顯微鏡下觀察顯示試驗組小鼠小腸出現(xiàn)連續(xù)性陽性染色，固有層中可見大量漿細胞及淋巴細胞等炎性細胞浸潤，多見陽性染色的淋巴細胞：且腸組織中IL-4和IFN-γ mRNA表達量與對照組相比均顯著增加(P＜0.01)，而IL-10和TGFβ1 mRNA表達量顯著降低：IgA免疫組化結果顯示，灌胃glycinin和β-conglycinin組小鼠小腸固有層lgA+漿細胞呈現(xiàn)明顯的陽性染色，說明腸道炎癥較高。上述結果表明大豆球蛋