Rb磷酸化及細(xì)胞內(nèi)分布在大腸癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究.pdf

1、目前我國大腸癌的發(fā)病率與病死率仍位于所有惡性腫瘤的前列,且有逐年上升的趨勢。大腸癌患者綜合治療的5年生存率徘徊在30％左右。目前影響大腸癌長期生存的主要原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,因此進(jìn)一步研究大腸癌的發(fā)生和發(fā)展,對于尋找新的治療手段并提高臨床治療效果具有重要意義。
　　RB基因是最早被克隆的抑癌基因,其蛋白表達(dá)產(chǎn)物就是視母細(xì)胞腫瘤抑制蛋白(Rb)。Rb在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮非常重要的作用,對保證細(xì)胞周期的穩(wěn)定有重要意義。Cdk4是細(xì)胞周期蛋

2、白依賴性激酶(Cdks)家族成員,且是G1期的重要因子,在一些腫瘤細(xì)胞株中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有Cdk4基因的擴(kuò)增、突變或高表達(dá)。Cdk4與Rb磷酸化以及出核有關(guān),它介導(dǎo)的磷酸化使得Rb發(fā)生失活。在G1期,Rb處于低磷酸化狀態(tài),并且主要集中在細(xì)胞核內(nèi)。而在S期,Rb則處于高磷酸化狀態(tài),即失活狀態(tài)。研究證實(shí),在成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期各個(gè)階段,Rb都限制性分布在細(xì)胞核內(nèi)。而將癌基因?qū)氤衫w維細(xì)胞內(nèi)后,Rb核質(zhì)比例則發(fā)生明顯的變化。
　　本課題通過研

3、究Cdk4和Rb磷酸化在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用和機(jī)制,在組織和細(xì)胞兩個(gè)水平,了解Rb及其磷酸化蛋白(pho-Rb)在正常粘膜、大腸息肉、大腸癌局部病灶中表達(dá)程度的差異,同時(shí)研究Cdk4導(dǎo)致Rb過磷酸化以及Rb自身細(xì)胞分布的改變對大腸癌腫瘤細(xì)胞周期和腫瘤侵襲性的作用,以進(jìn)一步探討大腸癌的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制,為今后可能的靶向治療提供理論依據(jù)。
　　第一部分大腸癌組織、腺瘤組織、以及正常粘膜組織中Rb、磷酸化Rb及Cdk4的表達(dá)

4、>　　目的:觀察Rb和Cdk4在大腸癌由正常粘膜—腺瘤性息肉—惡變過程中的表達(dá)水平有無差別,了解兩者在大腸癌發(fā)生過程中的可能作用。
　　方法:采集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院2009年5月至8月普外科及內(nèi)鏡中心手術(shù)切除的大腸癌和腺瘤性息肉標(biāo)本,以及正常粘膜組織,抽提組織蛋白及mRNA,通過Western Blot、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測并觀察組織中Rb,pho-Rb,Cdk4蛋白以及Cdk4 mRNA的表達(dá)薺異。
　　結(jié)果:

5、
　　1.Rb在大腸癌組織中的表達(dá)明顯高于腺瘤組織以及正常組織,并且以高磷酸化狀態(tài)為主,腺瘤組織及正常組織中兩者的表達(dá)無明顯差異。
　　2.Cdk4蛋白及mRNA的表達(dá)在正常組織、腺瘤組織以及大腸癌組織中依次升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.Rb在腺瘤晚期或癌變早期過程中表達(dá)升高,并在磷酸化作用下發(fā)生失活,可能參與大腸癌的發(fā)生過程。
　　2.Cdk4在大腸癌變過程中可能起一定作用,從腺瘤到癌變

6、這一變化過程可能與Rb的過磷酸化有關(guān),而在正常粘膜到腺瘤過程中,可能是通過其他途徑起作用。
　　第二部分限制Rb出核及過磷酸化Rb對大腸癌細(xì)胞侵襲性的影響
　　目的:細(xì)胞水平限制Rb出核或過磷酸化Rb,觀察大腸癌細(xì)胞侵襲性的改變,了解Rb細(xì)胞內(nèi)分布及磷酸化對腫瘤發(fā)展的作用。
　　方法:使用出核蛋白抑制物L(fēng)eptomycin B(LMB)處理大腸癌細(xì)胞Lovo株,使Rb限制性分布在細(xì)胞核內(nèi),通過腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)(Transw

7、ell法)觀察腫瘤細(xì)胞侵襲性的變化。從Lovo細(xì)胞中得到Cdk4全長基因,以pcDNA3-flag為載體,構(gòu)建Cdk4R24C突變質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Lovo細(xì)胞,Transwell法觀察腫瘤細(xì)胞侵襲性的變化。
　　結(jié)果:
　　1.30nM LMB限制Rb在細(xì)胞核內(nèi)的效果滿意。
　　2.將Rb限制在Lovo腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi),對于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期無明顯影響,腫瘤細(xì)胞侵襲性無顯著變化。
　　3.過磷酸化Rb可以改變Lovo腫