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文檔簡介
1、干擾素(IFNs)是病原微生物入侵,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的一類具有抗病毒活性的細胞因子,屬機體Ⅱ類細胞因子,在先天免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用。目前,根據(jù)氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特點以及受體特性等,將干擾素分為Ⅲ類:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素。Ⅲ型干擾素(IFN-λs)為2003年發(fā)現(xiàn)的一類新型干擾素,其抗病毒作用并不是直接殺傷病毒,而是通過與其特異受體IFNLR1和IL-10R2構(gòu)成的異源二聚體復(fù)合物結(jié)合,激活與Ⅰ型干擾素相似的JAK-STAT信號通路,
2、誘導(dǎo)一系列具有抗病毒作用的干擾素刺激基因(ISGs)。
本研究首次克隆獲得鵝Ⅲ型干擾素(goIFNL)及其特異受體(goIFNLR1)的cDNA序列,并進行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。goIFNL的cDNA序列獲得823 bp,包含一個完整的開放閱讀框,編碼189 aa; goIFNLR1序列獲得1952bp,包含一個完整的開放閱讀框,編碼512 aa。通過NJ法進化樹分析,顯示這兩個基因?qū)儆邙B類這一分支,與禽類親緣關(guān)系更為接近。<
3、br> 應(yīng)用實時熒光定量PCR方法對goIFNL和goIFNLR1的組織分布情況進行探索,結(jié)果顯示goIFNL主要分布在呼吸道組織肺臟(LU)、氣管(TR);胃腸道組織小腸(SI)、肌胃(GI);皮膚(SK);胰腺(P)及全血(Blood)等上皮細胞豐盛的組織中,其特異受體goIFNLR1具有相似的組織分布情況。
為了解goIFNL的免疫學(xué)特性,選用四種TLR的激動劑及三種禽類相關(guān)病毒分別刺激鵝外周血單核細胞建立體外感染細胞
4、模型,結(jié)果顯示在TLR3的激動劑Poly(I∶C)以及TLR9的激動劑ODN2006的刺激下,goIFNL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平得到顯著性的提升。在TLR4的激動劑LPS及TLR7的激動劑R848的刺激下,goIFNL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相較對照組無顯著性差異。goIFNLR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在這四種TLR的激動劑的刺激下相較對照組均無顯著性差異。緊接著,我們又探究了鵝重要傳染病的病毒病原對目標分子的影響:在小鵝瘟(GPV)病毒的感染
5、下,goIFNL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平具有顯著性的升高;在低致病性禽流感病毒(H9N2 AIV)及鴨坦布蘇病毒(DTMUV)的感染下,goIFNLmRNA的轉(zhuǎn)錄水平相較對照組無顯著性差異,而goIFNLR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在這三種病毒的刺激下均無顯著性差異。同時,選用這三種禽類病毒人工感染雛鵝建立體內(nèi)動物模型,經(jīng)qRT-PCR檢測goIFNL及goIFNLRI mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示在H9N2 AIV的感染下,goIFNL的表達
6、量相較對照組在肺臟組織(LU)中有近20倍的提升,存胰腺組織(P)中有近40倍的提升。而在其他兩種病毒的感染下,goIFNL及goIFNLR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相較對照組無顯著性差異。以上結(jié)果表明goIFNL在鵝的抗病毒固有免疫中扮演著一定的角色。
為進一步了解其生物學(xué)功能,選擇對goIFNL進行原核和真核表達,分別構(gòu)建pET-32α-goIFNL原核表達載體及pcDNA3.1-goIFNL真核表達載體。構(gòu)建的原核表達質(zhì)粒以
7、IPTG終濃度0.8mM誘導(dǎo)3h的條件在大腸桿菌BL21(DE3)中被成功誘導(dǎo)表達,表達的融合蛋白以包涵體形式存在。利用Ni-NTA親和層析純化重組goIFNL融合蛋白,并以此為免疫原制備鼠抗goIFNL多克隆抗體。經(jīng)Western-Blot驗證,真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1-goIFNL能在BHK21細胞中表達goIFNL蛋白,這為goIFNL抗病毒免疫學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
綜上,本研究成功克隆了goIFNL及goI
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